組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化
Summary
細胞外マトリックスリガンドは、ポリアクリルアミドヒドロゲル上にパターン化することができ、準拠基板上の閉じ込められたコロニーにおけるヒト胚性幹細胞の培養を可能にする。この方法は、トラクション力顕微鏡と生化学アッセイと組み合わせて、組織形状、細胞発生力、および運命指定の相互作用を調べることができます。
Abstract
ヒト胚性幹細胞は、胚発生時の一次胚層形成に対応する細胞運命仕様の自己組織化パターンにより、インビトロでモルフォゲンに応答するユニークな能力を示す。したがって、これらの細胞は、初期の人間の発達を駆動するメカニズムを調べる強力なツールを表します。我々は、コロニーの幾何学と機械的環境の両方を制御する準拠基板上の閉じ込められたコロニーにヒト胚性幹細胞を培養する方法を開発した。胚発生の根にはこの方法の主な特徴は、細胞の付着を促進するために表面に細胞外マトリックスリガンドの定義されたパターンを有するポリアクリルアミドヒドロゲルを生成する能力である。これは、所望の幾何学的パターンを持つステンシルを製造し、これらのステンシルを使用してガラスカバーリップ上の細胞外マトリックスリガンドのパターンを作成し、重合中にポリアクリルアミドヒドロゲルにこれらのパターンを移すことによって達成される。この方法はまた牽引力顕微鏡と互換性があり、ユーザーが限られたコロニー内の細胞発生力の分布を測定し、マッピングすることを可能にする。標準的な生化学的アッセイと組み合わせることで、これらの測定値を使用して、初期のヒト開発時の運命の仕様と形態形成における機械的手がかりの役割を調べることができます。
Introduction
ヒト胚性幹細胞(HESC)は、再生医療や組織工学の応用に大きな期待を寄せています。これらの細胞の多能性の性質は、それらに任意の成人細胞タイプに分化する能力を与える。hESCの運命を特定の細胞型に導く上で大きな進歩がなされているが、組織全体や器官de novo1、2、3、4を生成することは非常に困難なままである。 5.これは、大部分は、ヒトの発達中にこれらの組織の形成を駆動するメカニズムの限られた理解に起因する。この知識のギャップを埋めるために、近年、胚幹細胞6、7、8、9を用いて初期胚とその後の発達段階をモデル化する方法が数多く出現している。 ,10,11,12,13.
第1hESCライン14の導出直後に、HESCから形成された胚体体が3つの一次生殖層6の細胞を自発的に産生することができることが実証された。しかし、胚体の大きさと形態に対する本質的な制御の欠如のために、生殖層の組織は有意に変化し、初期胚の組織と一致しなかった。さらに最近では、Warmflashらは、マイクロパターニングを介してガラス基板上のHESCのコロニーを閉じ込める方法を開発し、コロニー8のサイズと形状に対する制御と一貫性を提供した。初期の開発における重要な形態原であるBMP4の存在下で、これらの限定コロニーは、一次胚芽層を表す運命に対する仕様の再現可能なパターンを自己組織化することが可能であった。これは、原発性生殖層が確立されるメカニズムを研究するための有用なモデルを提供したが、運命指定のパターンは、胚形成時に観察された組織および形態形成と正確に一致しなかった15。初期胚発生のより忠実な要約は、マトリゲル11の3次元細胞外マトリックス(ECM)にHESCを埋め込むことによって達成され、HESCが自己組織化し、モデル化する能力に関するこれまでで最も強力な証拠を提供した。胚発生の初期段階は生体内である。しかし、この方法は一貫性のない結果をもたらし、自己組織化と運命指定の根本的なメカニズムを明らかにするために使用できる多くのアッセイと互換性がありません。
これらの既存の方法とそれぞれの限界を考えると、我々は初期胚の細胞外環境をモデル化する条件下で定義された幾何学のhESCコロニーを再現可能に培養する方法を開発しようとした。これを達成するために、我々は、基板の機械的特性を制御するために、調整弾性のポリアクリルアミドヒドロゲルを使用しました。胃の胚に原子力顕微鏡を用いて、エピブラストの弾力性は数百個のパスカルから数キロパスカルまで及ぶことがわかった。そこで、hESCコロニーの基板として機能するために、この範囲で弾力性のあるポリアクリルアミドヒドロゲルの生成に焦点を当てました。我々は、コロニーの幾何学を堅牢に制御するために、ポリアクリルアミドヒドロゲル7、9上でHESCを培養するための以前の方法を変更した。我々は、以前に報告された16のように、マイクロファブリファリングステンシルを介してガラスカバーリップ上のECMリガンド、すなわちマトリゲルを最初にパターン化することによってこれを達成しました。その後、重合中にポリアクリルアミドヒドロゲルの表面にパターン化されたリガンドを移す新しい技術を設計した。ここで説明する方法は、所望の幾何学的パターンでシリコンウェーハを製造するためにフォトリソグラフィーを使用し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)でこれらの幾何学的特徴のスタンプを作成し、これらのスタンプを使用してステンシルを生成することを含みます。最終的には、ガラスカバーの表面にリガンドのパターニングを可能にし、ポリアクリルアミドに転送します。
初期胚の機械的環境を要約することに加えて、ポリアクリルアミドにhESCコロニーを閉じ込め、我々の前の方法9で報告したように、牽引力顕微鏡(TFM)を用いて細胞発生力の測定を可能にする。簡単に言えば、蛍光ビーズはポリアクリルアミドに埋め込まれ、受託マーカーとして使用することができる。細胞発生力は、パターン基板にHESCを播種した後のこれらのビーズの変位をイメージングすることによって計算される。さらに、得られた牽引力マップは、免疫染色などの従来のアッセイと組み合わせて、閉じ込められたhESCコロニーにおける細胞発生力の分布が下流シグナリングを調節または調節する方法を調べることができます。これらの方法は、現在見過ごされている初期の胚発生時に、機械的な力が細胞運命仕様のパターン化において重要な役割を果たしていることを明らかにすることを期待する。
Protocol
Representative Results
Discussion
長く詳細なプロトコルを簡素化するために、この方法は、1)ガラスカバースリップ上のECMリガンドのパターンを生成する、2)ゲルの重合時にポリアクリルアミドヒドロゲルにパターンを移す、および3)上のhESCのシードという3つの重要な段階で構成されています。パターン化されたヒドロゲル。これらの 3 つの段階のそれぞれで考慮する必要がある重要な手順があります。ガラスカバースリッ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CIRM助成金RB5-07409からの資金提供を認めしたいと思います。J.M.M.は、この方法の生成とトラブルシューティングを導いた様々な議論のために、フイブーンカイ、ドゥルヴ・タカール、ロジャー・オリアに感謝したいと思います。J.M.M.はまた、UCSFディスカバリー・フェローシップに感謝し、彼の仕事を継続的にサポートしてくださった。
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Riferimenti
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