Mønstre geometrien av menneskelige embryonale Stamcelle kolonier på kompatible underlag for å kontrollere vevs nivået mekanikk
Summary
Ekstracellulære matrise ligander kan være mønstret på polyakrylamid hydrogeler å aktivere kulturen i menneskets embryonale stamceller i trange kolonier på kompatible underlag. Denne metoden kan kombineres med traction Force mikroskopi og biokjemiske analyser for å undersøke samspillet mellom vev geometri, celle-genererte krefter, og skjebne spesifikasjon.
Abstract
Human embryonale stamceller demonstrere en unik evne til å reagere på morphogens in vitro av selv-organisering mønstre av celle skjebne spesifikasjon som tilsvarer primære bakterie lag formasjon under embryogenesis. Dermed disse cellene representerer et kraftig verktøy som å undersøke mekanismer som driver tidlig menneskelig utvikling. Vi har utviklet en metode for å kultur menneskelige embryonale stamceller i trange kolonier på kompatible underlag som gir kontroll over både geometrien av koloniene og deres mekaniske miljø for å recapitulate de fysiske parametrene som ligger til grunn embryogenesis. Nøkkelen ansiktstrekk av denne metoden er evnen å utvikle polyakrylamid hydrogeler med definerte mønstre av ekstracellulære matrise ligand for overflaten å fremme cellen feste. Dette oppnås ved fabrikere sjablonger med ønsket geometriske mønstre, ved hjelp av disse sjablonger for å lage mønstre av ekstracellulære matrise ligand på glass coverslips, og overføre disse mønstrene til polyakrylamid hydrogeler under polymerisering. Denne metoden er også kompatibel med traction Force mikroskopi, slik at brukeren kan måle og kartlegge fordelingen av celle-genererte krefter innenfor trange kolonier. I kombinasjon med standard biokjemiske analyser, kan disse målingene brukes til å undersøke rollen mekaniske signaler spille i skjebne spesifikasjon og morphogenesis under tidlig menneskelig utvikling.
Introduction
Human embryonale stamceller (hESCs) holder store løftet for bruk i regenererende medisin og vev engineering applikasjoner. Den pluripotent natur disse cellene gir dem muligheten til å differensiere til enhver voksen celle type. Mens store fremskritt har blitt gjort i regi skjebnen til hESCs til bestemte celletyper, har det vært svært vanskelig å generere hele vev eller organer de Novo1,2,3,4, fempå. Dette skyldes, i stor grad, til en begrenset forståelse av mekanismene som driver dannelsen av disse vev under menneskelig utvikling. For å fylle dette gapet i kunnskap, en rekke metoder har dukket opp de siste årene for å modellere tidlig embryo og påfølgende stadier av utviklingen med embryonale stamceller6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Kort tid etter avledning av de første hESC linjene14, ble det demonstrert at embryoid kropper dannet fra hESCs var i stand til spontant å produsere celler av de tre primære bakterie lag6. Men på grunn av iboende mangel på kontroll over størrelsen og morfologi av embryoid kropper, organisering av bakterie lag varierte betydelig og klarte ikke å matche organiseringen av tidlig embryo. Flere nylig, Warmflash et al. utviklet en metode for å begrense kolonier av hESCs på glass underlag via micropatterning, gi kontroll og konsistens over størrelsen og geometrien av koloniene8. I nærvær av BMP4, en viktig morphogen i tidlig utvikling, var disse trange kolonier i stand til selv-organisering reproduserbar mønstre av spesifikasjonen til skjebnen representerer den primære bakterie lag. Selv om dette ga en nyttig modell for å studere mekanismene som primære bakterie lag er etablert, mønstrene av skjebne spesifikasjonen ikke nøyaktig samsvarer med organisasjonen og morphogenesis observert under embryogenesis15. En mer trofast recapitulation av tidlig embryoutvikling ble oppnådd ved å innlemme hESCs i en tredimensjonal ekstracellulære matrise (ECM) av matrigel11, og gir den sterkeste bevis hittil for evnen til hESCs å selv-organisere og modell tidlige stadier av embryogenesis ex vivo. Imidlertid gir denne metoden inkonsekvente resultater og er dermed uforenlig med en rekke analyser som kan brukes til å avdekke de underliggende mekanismene for selv-organisering og skjebne spesifikasjon.
Gitt disse eksisterende metoder og deres respektive begrensninger, forsøkte vi å utvikle en metode for reproduserbar dyrking hESC kolonier av definert geometri i forhold som modell ekstracellulære miljøet på tidlig embryo. For å oppnå dette, brukte vi polyakrylamid hydrogeler av tunable elastisitet for å kontrollere de mekaniske egenskapene til underlaget. Ved hjelp av Atomic Force mikroskopi på gastrulation-scenen kylling embryo, fant vi ut at elastisiteten i epiblast varierte fra hundrevis av Pascal til noen kilopascal. Derfor fokuserte vi på å generere polyakrylamid hydrogeler med elastisitet i dette området for å tjene som underlaget for hESC kolonier. Vi endret våre tidligere metoder for dyrking hESCs påpolyakrylamid hydrogeler å gi robust kontroll over geometrien av koloniene. Vi oppnådde dette ved første mønster ECM ligander, nemlig matrigel, på glass coverslips gjennom microfabricated sjablonger, som tidligere rapportert16. Deretter utviklet vi en ny teknikk for å overføre den mønstrede ligand til overflaten av polyakrylamid hydrogeler under polymerisering. Metoden vi beskriver her innebærer å bruke foto litografi å dikte opp en silisium wafer med ønsket geometriske mønstre, lage frimerker av teser geometriske funksjoner med Polydimethylsiloxan (PDMS), og bruke disse stemplene til å generere sjablonger som til slutt tillate mønstre av ligand på overflaten av glass coverslips og overføre til polyakrylamid.
I tillegg til å recapitulating den mekaniske miljø av tidlig embryo, confining hESC kolonier på polyakrylamid muliggjør måling av celle-genererte krefter med traction Force mikroskopi (TFM), som rapportert i vår forrige metode9. I korte trekk kan fluorescerende perler bygges inn i polyakrylamid og brukes som fiducial markører. Celle-genererte krefter beregnes ved tenkelig forskyvning av disse perlene etter seeding hESCs på mønstret substrat. Videre kan de resulterende traction Force kart kombineres med tradisjonelle analyser, for eksempel immunostaining, for å undersøke hvordan fordelingen av celle-genererte styrker i trange hESC kolonier kan regulere eller modulere nedstrøms signalering. Vi forventer at disse metodene vil avdekke at mekaniske krefter spiller en avgjørende rolle i mønstre av celle skjebne spesifikasjon under tidlig embryoutvikling som er oversett.
Protocol
Representative Results
Discussion
For å forenkle en lang og detaljert protokoll, består denne metoden av tre kritiske stadier: 1) genererer mønstre av ECM ligand på glass coverslips, 2) overføre mønstrene til polyakrylamid hydrogeler under polymerisering av gel, og 3) seeding hESCs på mønstret hydrogel. Det er viktige trinn som må vurderes på hver av disse tre stadiene. For å generere High-Fidelity mønstre på glasset coverslips, må sjablongen være fast presset på dekkglass for å hindre lekkasje av ligand løsning og alle luftbobler må f…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne erkjenne finansiering fra CIRM stipend RB5-07409. J.M.M. ønsker å takke FuiBoon Kai, Dhruv thakar, og Roger Oria for ulike diskusjoner som guidet generering og feilsøking av denne metoden. J.M.M. også takket UCSF Discovery Fellowship for den pågående støtte av sitt arbeid.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Riferimenti
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
