Mönster av geometrin hos humana embryonala stamcells kolonier på överensstämmande substrat för att kontrollera vävnadsnivå mekanik
Summary
Extracellulära matrix ligander kan mönstra på polyakrylamidhydrogels för att möjliggöra kulturen av mänskliga embryonala stamceller i trånga kolonier på överensstämmande substrat. Denna metod kan kombineras med dragkraft mikroskopi och biokemiska analyser för att undersöka samspelet mellan vävnad geometri, cell-genererade krafter, och öde specifikation.
Abstract
Mänskliga embryonala stamceller visar en unik förmåga att reagera på morfogener in vitro genom självorganiserande mönster av cell öde specifikation som motsvarar primära köns skiktet bildas under embryogenes. Således, dessa celler utgör ett kraftfullt verktyg för att undersöka de mekanismer som driver tidig mänsklig utveckling. Vi har utvecklat en metod för att odla mänskliga embryonala stamceller i trånga kolonier på överensstämmande substrat som ger kontroll över både geometrin hos kolonierna och deras mekaniska omgivning för att rekapitulera de fysikaliska parametrar som ligger bakom embryogenes. Det viktigaste inslaget i denna metod är förmågan att generera polyakrylamidhydrogels med definierade mönster av extracellulära matrix ligand vid ytan för att främja cell infästning. Detta uppnås genom att tillverka stenciler med önskad geometriska mönster, med hjälp av dessa stenciler för att skapa mönster av extracellulära matrix ligand på glas täckband, och överföra dessa mönster till polyakrylamidhydrogels under polymerisation. Denna metod är också kompatibel med dragkraft mikroskopi, så att användaren kan mäta och kartlägga fördelningen av cell-genererade krafter inom de trånga kolonierna. I kombination med standard biokemiska analyser kan dessa mätningar användas för att undersöka den roll som mekaniska signaler spelar i ödet specifikation och morfogenes under tidig mänsklig utveckling.
Introduction
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har ett stort löfte om användning inom regenerativ medicin och vävnadstekniska tillämpningar. Den pluripotenta karaktären av dessa celler ger dem möjlighet att differentiera till någon vuxen celltyp. Även om stora framsteg har gjorts för att styra ödet för hESCs till vissa celltyper, har det varit mycket svårt att generera hela vävnader eller organ de Novo1,2,3,4, 5. Detta beror till stor del på en begränsad förståelse av de mekanismer som driver bildandet av dessa vävnader under mänsklig utveckling. För att fylla denna kunskapsklyfta har ett antal metoder framkommit under de senaste åren för att modellera det tidiga embryot och senare utvecklingsstadier med embryonala stamceller6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Kort efter härledningen av den första hESC-linjen14, visades det att embryoida kroppar bildade från hESCs kunde spontant producera celler av de tre primära bakterie lagren6. Men på grund av den inneboende bristen på kontroll över storleken och morfologin av embryoid organ, organisationen av köns lagren varierade betydligt och misslyckats med att matcha organisationen av det tidiga embryot. På senare tid, Warmflash et al. utvecklat en metod för att begränsa kolonier av hESCs på glas substrat via micropatterning, som ger kontroll och konsistens över storleken och geometri av kolonierna8. I närvaro av BMP4, en viktig morfogen i tidig utveckling, var dessa trånga kolonier kan självorganiserande reproducerbara mönster av specifikation till öden som representerar den primära bakterie lagren. Även om detta gav en användbar modell för att studera de mekanismer genom vilka primära bakterie skikt är etablerade, mönster av öde specifikation matchade inte exakt den organisation och morfogenes observerats under embryogenes15. En mer trogen rekapitulation av tidig embryonal utveckling uppnåddes genom inbäddning hESCs i en tredimensionell extracellulär matris (ECM) av matrigel11, vilket ger de starkaste bevisen hittills för förmåga hESCs att själv organisera och modell tidiga stadier av embryogenes ex vivo. Denna metod ger dock inkonsekventa resultat och är därmed oförenlig med ett antal analyser som kan användas för att avslöja de bakomliggande mekanismerna för självorganisering och öde specifikation.
Med tanke på dessa befintliga metoder och deras respektive begränsningar, vi försökte utveckla en metod för reproducerbart odling hESC kolonier av definierade geometrier under förhållanden som modellerar den extracellulära miljön i det tidiga embryot. För att uppnå detta använde vi polyakrylamidhydrogels av avstämbar elasticitet för att kontrollera de mekaniska egenskaperna hos underlaget. Med hjälp av atomkraft mikroskopi på gastrulation-steg kyckling embryon, fann vi att elasticiteten i epiblast varierade från hundratals Pascal till några kilopascal. Därför fokuserade vi på att generera polyakrylamidhydrogels med elasticitet i detta intervall för att fungera som substrat för hESC-kolonier. Vi ändrade våra tidigare metoder för odling av hESCs på polyakrylamidhydrogels7,9 för att ge robust kontroll över koloniernas geometri. Vi uppnådde detta genom att först mönka ECM ligands, nämligen matrigel, på glas täckband genom microfabricerade stenciler, som tidigare rapporterats16. Vi konstruerade sedan en ny teknik för att överföra den mönstrade ligand till ytan av polyakrylamidhydrogels under polymerisation. Den metod som vi beskriver här innebär att använda Photolithography att tillverka en kisel wafer med önskad geometriska mönster, skapa stämplar av avhandlingar geometriska egenskaper med Polydimetylsiloxan (PDMS), och använda dessa stämplar för att generera stenciler som Slutligen tillåta mönkning av ligand på ytan av glas täckband och överföring till polyakrylamid.
Förutom att sammanfatta den mekaniska miljön i det tidiga embryot, gör det möjligt att begränsa hESC-kolonierna på polyakrylamid för att mäta cellgenererade krafter med traktionskraftsmikroskopi (TFM), vilket rapporteras i vår tidigare metod9. I korthet kan fluorescerande pärlor bäddas in i polyakrylamid och användas som relaterat markörer. Cellgenererade krafter beräknas genom att avbilda förskjutningen av dessa pärlor efter sådd hESCs på det mönstrade underlaget. Dessutom kan de resulterande dragkrafts kartorna kombineras med traditionella analyser, såsom immunofärgning, för att undersöka hur distributionen av cellgenererade krafter i slutna hESC-kolonier kan reglera eller modulera nedströms signalering. Vi förväntar oss att dessa metoder kommer att avslöja att mekaniska krafter spelar en avgörande roll i mönkning av cell Fate specifikation under tidig embryonal utveckling som för närvarande förbises.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att förenkla ett långt och detaljerat protokoll består denna metod av tre kritiska steg: 1) generera mönster av ECM ligand på glas täckband, 2) överföra mönstren till polyakrylamidhydrogels under polymerisation av gelen och 3) seedning av hESCs på mönstrad hydrogel. Det finns kritiska steg som måste övervägas vid var och en av dessa tre stadier. För att generera High-Fidelity mönster på glaset täckband, måste stencilen pressas fast på täckglas för att förhindra läckage av ligand lösning och …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill gärna bekräfta finansieringen från CIRM Grant RB5-07409. J.M.M. skulle vilja tacka FuiBoon Kai, Dhruv thakar, och Roger Oria för olika diskussioner som guidade generering och felsökning av denna metod. J.M.M. också tack UCSF Discovery Fellowship för det fortsatta stödet för sitt arbete.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Riferimenti
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
