Doku Seviyesi Mekaniğinin Kontrol Altına Almak İçin Uyumlu Yüzeylerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kolonilerinin Geometrisinin Desenlemi
Summary
Hücre dışı matriks ligandlar poliakrilamid hidrojeller üzerine uyumlu yüzeyler üzerinde sınırlı kolonilerde insan embriyonik kök hücrelerin kültürünü sağlamak için desenli olabilir. Bu yöntem, doku geometrisi, hücre tarafından oluşturulan kuvvetler ve kader özellikleri arasındaki etkileşimi incelemek için çekiş kuvveti mikroskobu ve biyokimyasal tahlillerle kombine edilebilir.
Abstract
İnsan embriyonik kök hücreleri, embriyogenez sırasında birincil mikrop tabakası oluşumuna karşılık gelen hücre kader özelliklerinin kendi kendini organize eden kalıpları ile morfojenlere in vitro yanıt verme yeteneğini gösterir. Böylece, bu hücreler ile erken insan gelişimini sürücü mekanizmaları incelemek için güçlü bir araç temsil eder. İnsan embriyonik kök hücrelerini, kolonilerin geometrisi ve mekanik çevreleri üzerinde kontrol sağlayan uyumlu yüzeyler üzerinde, sınırlı kolonilerde kültüre getirmek için bir yöntem geliştirdik. altında yatan embriyogenez. Bu yöntemin en önemli özelliği hücre eki teşvik etmek için yüzeyde ekstrasellüler matriks ligand tanımlanmış desenleri ile poliakrilamid hidrojeller oluşturmak için yeteneğidir. Bu, istenilen geometrik desenlerle şablonlar üreterek, bu şablonları kullanarak cam kapaklar üzerinde hücre dışı matris ligand desenleri oluşturarak ve polimerizasyon sırasında bu desenlerin poliakrilamid hidrojellere aktarılması yla elde edilir. Bu yöntem aynı zamanda çekiş kuvveti mikroskobu ile uyumludur, böylece kullanıcı hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin sınırlı koloniler içindeki dağılımını ölçer ve haritalayabilir. Standart biyokimyasal tahlillerle birlikte, bu ölçümler mekanik ipuçlarının erken insan gelişimi sırasında kader belirtimi ve morfogenezde oynadığı rolü incelemek için kullanılabilir.
Introduction
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) rejeneratif tıp ve doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere büyük umut tutun. Bu hücrelerin pluripotent doğası onlara herhangi bir yetişkin hücre tipi ne kadar ayırt etme yeteneği verir. HESC’lerin kaderini belirli hücre tiplerine yönlendirmede büyük adımlar atılsa da, tüm doku veya organların oluşturulması çok zor kalmıştır de novo1,2,3,4, 5. Bunun nedeni, büyük ölçüde, insan gelişimi sırasında bu dokuların oluşumunu sürücü mekanizmaların sınırlı bir anlayış. Bilgideki bu boşluğu doldurmak için, embriyonik kök hücreler6,7,8,9 ile erken embriyo ve sonraki gelişim aşamalarını modellemek için son yıllarda bir dizi yöntem ortaya çıkmıştır ,10,11,12,13.
İlk hESC hatlarının türetilmesinden kısa bir süre sonra14, hESC’lerden oluşan embriyoid cisimlerin üç ana mikrop tabakasının hücrelerini kendiliğinden üretebildiği gösterilmiştir6. Ancak, embriyoid cisimlerin büyüklüğü ve morfolojisi üzerinde kontrol doğal eksikliği nedeniyle, mikrop katmanları nın organizasyonu önemli ölçüde çeşitli ve erken embriyo organizasyonu maç başarısız oldu. Daha yakın zamanlarda, Warmflash ve ark. mikro desenleme yoluyla cam yüzeyler üzerinde hESC kolonileri sınırlamak için bir yöntem geliştirdi, kolonilerin boyutu ve geometrisi üzerinde kontrol ve tutarlılık sağlayan8. Erken gelişimde önemli bir morfojen olan BMP4’ün varlığında, bu sınırlı koloniler birincil mikrop tabakalarını temsil eden kaderlere göre kendi kendini organize edebilen tekrarlanabilir örüntüler üretebilme yeteneğine sahiplerdi. Bu, birincil mikrop tabakalarının oluşturuldurulan mekanizmaların incelenmesi için yararlı bir model sunmasına rağmen, kader belirtiminin kalıpları embriyogenez 15 sırasında gözlenen organizasyon ve morfogenez ile tam olarak uyuşmadı15. Erken embriyonik gelişimin daha sadık bir recapitulation üç boyutlu ekstrasellüler matris (ECM) matrigel11hESCs gömme tarafından elde edildi , kendi kendini organize ve model hESCyeteneği için bugüne kadar en güçlü kanıt sağlayan embriyogenez ex vivo erken aşamalarında. Ancak, bu yöntem tutarsız sonuçlar verir ve bu nedenle öz-organizasyon ve kader belirtimi temel mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek tahliller bir dizi ile uyumsuzdur.
Bu mevcut yöntemler ve bunların ilgili sınırlamaları göz önüne alındığında, erken embriyonun hücre dışı ortamını modelleyen koşullarda tanımlanmış geometrilerin hESC kolonilerini tekrartekrar örmek için bir yöntem geliştirmeye çalıştık. Bunu başarmak için, substrat mekanik özelliklerini kontrol etmek için ölçülabilir elastikiyet poliakrilamid hidrojeller kullanılır. Gastrulation aşamasındaki tavuk embriyolarında atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak epiblastın elastikiyetinin yüzlerce pascal’dan birkaç kilopascal’a kadar değiştiğine rastladık. Böylece, hESC kolonileri için substrat olarak hizmet vermek için bu aralıkta elastikiyeti ile poliakrilamid hidrojeller üretmeye odaklandık. Kolonilerin geometrisi üzerinde sağlam bir kontrol sağlamak için poliakrilamidhidrojeller 7,9 üzerinde hESCs kültür için önceki yöntemleri ni modifiye. Biz ilk desenleme ECM ligands, yani matrigel, cam kapakları üzerine mikrofabrikasi şablonlar aracılığıyla, daha önce rapor16ile elde etti. Daha sonra polimerizasyon sırasında poliakrilamid hidrojellerin yüzeyine desenli ligand aktarmak için yeni bir teknik tasarladık. Burada tanımladığımız yöntem, istenilen geometrik desenlerle silikon bir gofret üretmek için fotolitografi kullanmak, polidimethylsiloxane (PDMS) ile geometrik tezlerin pullarını oluşturmak ve bu pulları kullanarak şablonları oluşturmak için sonuçta cam kapakları yüzeyine ligand desenleme ve poliakrilamid transfer sağlar.
Erken embriyonun mekanik ortamının yeniden özetlenmesinin yanı sıra, hESC kolonilerinin poliakrilamid ile sınırlanması, önceki yöntemimizde bildirildiği gibi, çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) ile hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin ölçülmesini sağlar9. Kısaca, floresan boncuk poliakrilamid gömülü ve fiducial belirteçleri olarak kullanılabilir. Hücre tarafından oluşturulan kuvvetler, bu boncukların desenli substrat üzerine hESC’ler tohumladıktan sonra yer değiştirmelerinin görüntülenmesiyle hesaplanır. Ayrıca, ortaya çıkan çekiş kuvveti haritaları, sınırlı hESC kolonilerinde hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin dağılımının aşağı sinyalizasyonu nasıl düzenleyebileceğini veya modüle edebileceğini incelemek için immünboyama gibi geleneksel tahlillerle birleştirilebilir. Bu yöntemlerin, mekanik kuvvetlerin şu anda gözden kaçan erken embriyonik gelişim sırasında hücre kaderi spesifikasyonunun desenlemesinde kritik bir rol oynadığını ortaya çıkarmasını bekliyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uzun ve ayrıntılı bir protokolü basitleştirmek için, bu yöntem üç kritik aşamadan oluşur: 1) cam kapaklar üzerinde ECM ligand desenleri üreten, 2) jel polimerizasyonu sırasında poliakrilamid hidrojeller için desenler transfer, ve 3) üzerinde tohumlama hESCs desenli hidrojel. Bu üç aşamanın her birinde göz önünde bulundurulması gereken kritik adımlar vardır. Cam kapaklarda yüksek doğruluk desenleri oluşturmak için, ligand çözeltisinin sızmasını önlemek için şablon kapak kapağına s?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz CIRM hibe RB5-07409 gelen finansman kabul etmek istiyorum. J.M.M. fuiBoon Kai, Dhruv Thakar ve Roger Oria’ya bu yöntemin neslini ve sorun gidermelerini yönlendiren çeşitli tartışmalar için teşekkür eder. J.M.M. ayrıca UCSF Discovery Bursu’na çalışmalarının sürekli desteği için teşekkür eder.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Riferimenti
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
