Modelo de bexiga de urina de urina descentralizada (Ex Vivo) com o músculo destrusor removido para acesso direto ao suburotelio durante o enchimento da bexiga
Summary
O modelo de bexiga livre de detrusor permite o acesso direto ao suburotelio para estudar os mecanismos locais de regulação da disponibilidade de mediadores biologicamente ativos na propria suburotelio/laminado durante o armazenamento e a anulação da urina. A preparação assemelha-se pròxima ao enchimento de uma bexiga intata e permite que os estudos do pressão-volume sejam executados sem influências sistemáticas.
Abstract
Estudos anteriores estabeleceram a liberação de substâncias químicas de folhas de mucosa de bexiga plana afixadas nas câmaras de Ussing e expostas a mudanças na pressão hidrostática ou alongamento mecânico e de células urotelia cultivadas após alterações de pressão hidrostática, alongamento, inchaço celular ou forças de arrasto, e em lúmen da bexiga no final do enchimento. Tais achados levaram à suposição de que esses mediadores também são liberados em suburotelio (SubU)/lamina propria (LP) durante o enchimento da bexiga, onde afetam as células profundas na parede da bexiga para, em última análise, regular a excitabilidade da bexiga. Há pelo menos duas limitações óbvias em tais estudos: 1) nenhuma dessas abordagens fornece informações diretas sobre a presença de mediadores em SubU/LP, e 2) os estímulos utilizados não são fisiológicos e não recapitulam o preenchimento autêntico da bexiga. Aqui, discutimos um procedimento que permite o acesso direto à superfície suburotelial da mucosa da bexiga no decorrer do enchimento da bexiga. A preparação livre de intrusão de urina que criamos se assemelha ao enchimento da bexiga intacta e permite que estudos de volume de pressão sejam realizados na bexiga na ausência de sinalização confusa de reflexos espinhais e músculos suaves destruor. Usando o modelo de bexiga livre de detrusor, demonstramos recentemente que medições intravesivas de mediadores não podem ser usadas como um proxy para o que foi lançado ou presente no SubU/LP durante o enchimento da bexiga. O modelo permite o exame de moléculas de sinalização derivadas de urotelium que são liberadas, geradas pelo metabolismo e/ou transportadas para o SubU/LP durante o recheio da bexiga para transmitir informações aos neurônios e músculos lisos da bexiga e regular sua excitabilidade durante continência e micturição.
Introduction
O objetivo deste modelo é permitir o acesso direto ao lado submucosato da mucosa da bexiga durante diferentes fases do enchimento da bexiga.
A bexiga deve abster-se de contração prematura durante o enchimento e vazio quando o volume crítico e a pressão são alcançados. Continência anormal ou voiding da urina são freqüentemente associados com excitabilidade anormal do músculo liso detrusor (DSM) no curso do enchimento da bexiga. Excitabilidade do DSM é determinada por fatores intrínsecos às células musculares lisas e por influências geradas por diferentes tipos de células dentro da parede da bexiga. A parede da bexiga urinária consiste em urotelio (mucosa), suburotelio (SubU)/lamina propria (LP), músculo suave detrusor (DSM) e serosa (Figura 1A). O urotelio consiste em células guarda-chuva (ou seja, a camada mais externa do urotelio), células intermediárias e células basais (ou seja, a camada mais interna do urotelio). Vários tipos de células, incluindo células intersticiais, fibroblastos, terminais nervosos aferentes, pequenos vasos sanguíneos e células imunes residem no SubU/LP. É amplamente assumido que o urotelio da bexiga é um órgão sensorial que inicia mictura e continência reflexa, liberando mediadores na submucosa que afetam as células do SubU/ LP e do DSM1,2,3. Para a maior parte, tais pressupostos são baseados em estudos que demonstraram liberação de mediadores: a partir de pedaços de mucosa expostos a mudanças na pressão hidrostática4,5; de células uroteliais cultivadas expostas ao trecho6,7,célulainduzida pela hipotonicidade inchando7 ou forças de arrasto8; de tiras de parede da bexiga isoladas sobre receptor ou ativação nervosa9,10,11,12,13,14; e na bexiga lúmen no final da bexiga enchimento15,16,17,18,19. Embora tais estudos foram fundamentais para demonstrar a liberação de mediadores sobre a estimulação mecânica de segmentos da parede da bexiga ou células uroteliais cultivadas, eles precisam ser apoiados por evidências diretas para a liberação de mediadores na submucosa que é eliciada por estímulos fisiológicos que reproduzem o enchimento da bexiga. Esta é uma tarefa desafiadora, dado que o SubU / LP está localizado no fundo da parede da bexiga dificultando o acesso direto à vizinhança de SubU / LP durante o enchimento da bexiga.
Aqui, ilustramos um modelo descentralizado (ex vivo) da bexiga da urina com o músculo detrusor removido13 que foi desenvolvido para facilitar estudos nos mecanismos locais do mechanotransduction que participam na sinalização entre o urothelium da bexiga, dSM e outros tipos da pilha na parede da bexiga. Esta abordagem é superior ao uso de folhas de parede da bexiga plana, tiras de parede da bexiga ou células uroteliais cultivadas porque permite medições diretas nas proximidades de SubU/LP de mediadores derivados de urotelium que são liberados ou formados em resposta a pressões fisiológicas e volumes na bexiga e evita possíveis mudanças fenotípicas na cultura celular. Ele pode ser usado para medir a disponibilidade, liberação, metabolismo e transporte transurotelial de mediadores em SubU/LP em diferentes estágios de enchimento da bexiga (Figura 1B). A preparação também pode ser usada para examinar a sinalização urotelial e mechanotransdução em modelos de síndromes da bexiga hiperativa e subativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
A bexiga tem duas funções: armazenamento e voiding da urina. O funcionamento normal dessas funções requer sensoriamento mecânico adequado de volume e pressão intralumínio e transdução de sinais através de células na parede da bexiga para regular a excitabilidade muscular detrusora. Acredita-se que a mucosa da bexiga (urotelio) regule a excitabilidade da bexiga, liberando uma variedade de moléculas de sinalização no SubU/LP que afetam vários tipos de células na parede da bexiga. Atualmente, a maioria das t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais Grant DK41315.
Materials
| CaCl2 | Fisher | C79 | Source flexible |
| Dextrose | Fisher | D16 | Source flexible |
| Dissecting pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Source flexible |
| Infusion Pump | Kent Scientific | GenieTouch | Source flexible |
| KCl | Fisher | P217 | Source flexible |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Source flexible |
| Light source | SCHOTT ACEI | Source flexible | |
| Microscope | Olympus SZX7 | Flexible to use any scope | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Source flexible |
| NaCl | Fisher | S671 | Source flexible |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Source flexible |
| Needles 25G | Becton Dickinson | 305122 | Source flexible |
| Organ bath | Custom made | Flexible source; We made it from Radnoti dissecting dish | |
| PE-20 tubing | Intramedic | 427405 | Source flexible |
| Pressure transducer | AD instrument | Source flexible | |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Source flexible |
| Software pressure-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Suture Nylon, 6-0 | AD surgical | S-N618R13 | Source flexible |
| Suture Silk, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Source flexible |
| Syringes 1 ml | Becton Dickinson | 309602 | Source flexible |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Source flexible |
| Water circulator | Baxter | K-MOD 100 | Source flexible |
Riferimenti
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