الترقيع المهندس بالأنسجة لإعادة بناء المريء المحيطي في الفئران
Summary
إعادة بناء المريء هو إجراء صعب ، وتطوير المريء المهندسة الأنسجة التي تمكن من تجديد الغشاء المخاطي المريء والعضلات والتي يمكن زرعها كطعم اصطناعي أمر ضروري. هنا ، نقدم بروتوكولنا لتوليد المريء الاصطناعي ، بما في ذلك تصنيع السقالات ، وزراعة المفاعلات الحيوية ، والتقنيات الجراحية المختلفة.
Abstract
استخدام المواد المتوافقة بيولوجيا لإعادة بناء المريء المحيطي هو مهمة صعبة من الناحية الفنية في الفئران ويتطلب تقنية زرع الأمثل مع الدعم الغذائي. في الآونة الأخيرة ، كانت هناك العديد من المحاولات في هندسة أنسجة المريء ، ولكن معدل النجاح كان محدودًا بسبب صعوبة الظهارة المبكرة في البيئة الخاصة للتمعش. هنا ، قمنا بتطوير مريء اصطناعي يمكن أن يحسن تجديد الغشاء المخاطي للمريء وطبقات العضلات من خلال سقالة أنبوبية ذات طبقتين ، ونظام مفاعل حيوي قائم على الخلايا الجذعية المتوسطة ، وتقنية تغذية مجازة مع تعديل استئصال المعدة. تتكون السقالة من ألياف النانو من البولي يوريثين (PU) في شكل أسطواني مع حبلا بوليكابرولاكتكونون مطبوع ثلاثي الأبعاد (3D) ملفوفحول الجدار الخارجي. قبل زرع، تم زرع الخلايا الجذعية المتوسطة المشتقة من الإنسان في تجويف السقالة، وأجريت زراعة المفاعل الحيوي لتعزيز التفاعل الخلوي. لقد قمنا بتحسين معدل البقاء على قيد الحياة من خلال تطبيق الأنستوم الجراحي وتغطية الطرف الاصطناعي المزروع برفرف الغدة الدرقية ، يليه تغذية مؤقتة غير العضو المعدي غير الفموي. وكانت هذه الطعوم قادرة على تلخيص نتائج الظهارية الأولية وتجديد العضلات حول المواقع المزروعة، كما يتضح من التحليل النسيجي. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت زيادة ألياف الإيلاستين والأوعية الدموية الجديدة في محيط الكسب غير المشروع. لذلك، يقدم هذا النموذج تقنية جديدة محتملة لإعادة بناء المريء المحيطي.
Introduction
يمكن أن يؤدي علاج اضطرابات المريء، مثل التشوهات الخلقية وسرطان المريء، إلى فقدان الجزء الهيكلي للمريء. في معظم الحالات ، تم تنفيذ الطعوم البديلة الذاتية ، مثل قنوات سحب المعدة أو تداخل القولون ،1،2. ومع ذلك ، فإن هذه بدائل المريء لديها مجموعة متنوعة من المضاعفات الجراحية ومخاطر إعادة التشغيل3. وهكذا ، فإن استخدام سقالات المريء المهندسة الأنسجة التي تحاكي المريء الأصلي يمكن أن يكون استراتيجية بديلة واعدة لإعادة تجديد الأنسجة المفقودة في نهاية المطاف4،5،6.
على الرغم من أن المريء المهندسة الأنسجة يحتمل أن يقدم بديلا للعلاجات الحالية من عيوب المريء، وهناك حواجز كبيرة لتطبيقه في الجسم الحي. تسرب الأنستوموموت بعد الجراحة ونخر سقالة المريء المزروعة يؤدي حتما إلى عدوى قاتلة من الفضاء العقيم المحيطة بها، مثل mediastinum7. لذلك ، من المهم للغاية منع تلوث الطعام أو اللعاب في الجرح والأنبوب الأنفي. وينبغي النظر في استئصال المعدة أو التغذية عن طريق الوريد حتى يتم الانتهاء من التئام الجروح الأولية. حتى الآن ، تم إجراء هندسة أنسجة المريء في نماذج الحيوانات الكبيرة لأنه لا يمكن تغذية الحيوانات الكبيرة إلا عن طريق فرط الوريد لمدة 2-4 أسابيع بعد زرع السقالة8. ومع ذلك ، لم يتم إنشاء مثل هذا النموذج التغذية غير الشفوية للبقاء على قيد الحياة في وقت مبكر بعد زرع المريء في الحيوانات الصغيرة. وذلك لأن الحيوانات كانت نشطة للغاية ولا يمكن السيطرة عليها ، لذلك لم تتمكن من الحفاظ على أنبوب التغذية في بطونها لفترة طويلة من الزمن. لهذا السبب، كانت هناك حالات قليلة من زرع المريء الناجح في الحيوانات الصغيرة.
في ضوء ظروف هندسة الأنسجة المريء، قمنا بتصميم سقالة أنبوبي من طبقتين تتكون من ألياف نانوية كهربائية (طبقة داخلية. الشكل 1A)وحبلا ً مطبوعًا ثلاثي الأبعاد (الطبقة الخارجية؛ الشكل 1B)بما في ذلك تقنية استئصال المعدة المعدلة. يرصد الألياف النانوية الداخلية من PU، البوليمر غير قابلة للتحلل، ويمنع تسرب الطعام واللعاب. مصنوعة خيوط المطبوعة الخارجية 3D من البولي كابرولاكدون القابلة للتحلل (PCL)، والتي يمكن أن توفر المرونة الميكانيكية والتكيف مع الحركة المعتمية. تم بذر الخلايا الجذعية المتوسطة المشتقة من الدهنية البشرية (hAD-MSCs) على الطبقة الداخلية من السقالة لتعزيز إعادة النعت. يمكن لهيكل الألياف النانوية تسهيل التجدد المخاطي الأولي من خلال توفير بيئة مصفوفة خارج الخلية الهيكلية (ECM) لهجرة الخلايا.
كما قمنا بزيادة معدل البقاء على قيد الحياة والنشاط الحيوي للخلايا المنهوجة من خلال زراعة المفاعلات الحيوية. تم تغطية السقالة المزروعة برفرف الغدة الدرقية لتمكين تجديد أكثر استقرارًا للغشاء المخاطي للمريء وطبقة العضلات. في هذا التقرير ، نصف بروتوكولات تقنيات هندسة أنسجة المريء ، بما في ذلك تصنيع السقالات ، وزراعة الخلايا الجذعية القائمة على الخلايا الحيوية ، وتقنية التغذية الالتفافية مع استئصال المعدة المعدل ، والجراحة المعدلة تقنية anastomosis لإعادة بناء المريء المحيطي في نموذج الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا تزال الدراسات الحيوانية الحالية على المريء الاصطناعي محدودة بعدة عوامل حاسمة. يجب أن تكون سقالة المريء الاصطناعية المثالية متوافقة بيولوجيًا ولها خصائص فيزيائية ممتازة. يجب أن تكون قادرة على تجديد ظهارة الغشاء المخاطي في الفترة المبكرة بعد الجراحة لمنع تسرب anastomotic. تجديد الطبقات العض…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل مشروع البحث والتطوير في مجال تكنولوجيا الصحة في كوريا من خلال معهد تطوير الصناعة الصحية الكوري (KHIDI) ، الذي تموله وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية ، جمهورية كوريا (رقم المنحة: HI16C0362) وأبحاث العلوم الأساسية برنامج من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) بتمويل من وزارة التربية والتعليم (2017R1C1B2011132). تم توفير العينات الحيوية والبيانات المستخدمة في هذه الدراسة من قبل البنك الحيوي لمستشفى جامعة سيول الوطنية، وهو عضو في شبكة بيوبنك الكورية.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
Riferimenti
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
