Væv-Manipuleret Graft for circumferential esophageal rekonstruktion hos rotter
Summary
Esophageal rekonstruktion er en udfordrende procedure, og udvikling af en væv-manipuleret spiserøret, der muliggør regenerering af esophageal slimhinde og muskler, og som kan implanteres som en kunstig graft er nødvendig. Her præsenterer vi vores protokol til at generere en kunstig spiserøret, herunder stilladsfremstilling, bioreaktordyrkning og forskellige kirurgiske teknikker.
Abstract
Brugen af biokompatible materialer til circumferential esophageal rekonstruktion er en teknisk udfordrende opgave hos rotter og kræver en optimal implantatteknik med ernæringsmæssig støtte. For nylig har der været mange forsøg på esophageal vævsteknik, men succesraten har været begrænset på grund af vanskeligheder med tidlig tilnavnisering i det særlige miljø af peristalsis. Her udviklede vi en kunstig spiserøret, der kan forbedre regenereringen af den esophageal slimhinde og muskel lag gennem en to-lags rørformede stillads, en mesenkymal stamceller-baserede bioreaktor system, og en bypass fodring teknik med modificeret Gastrostomi. Stilladset er lavet af polyurethan (PU) nanofibre i en cylindrisk form med en tredimensionel (3D) trykt polycaprolactone streng viklet rundt om den ydre væg. Før transplantation, menneskeskabte mesenkymale stamceller blev seedet ind i lumen af stilladset, og bioreaktor dyrkning blev udført for at øge cellulære reaktivitet. Vi forbedrede graft overlevelsesraten ved at anvende kirurgisk anastomose og dækker den implanterede protese med en skjoldbruskkirtel flap, efterfulgt af midlertidig nonoral gastrostomi fodring. Disse grafts var i stand til at opsummere resultaterne af indledende epitelisering og muskel regenerering omkring de implanterede steder, som det fremgår af histologisk analyse. Desuden blev øget elastinfibre og neovaskularisering observeret i graftens periferi. Derfor præsenterer denne model en potentiel ny teknik til circumferential esophageal rekonstruktion.
Introduction
Behandling af esophageal lidelser, såsom medfødte misdannelser og esophageal karcinomer, kan føre til strukturelle segment tab af spiserøret. I de fleste tilfælde er der udført autologe erstatningstransplantater, såsom gastrisk pull-up-ledninger eller koloninterpositioner,1,2. Men, disse esophageal udskiftninger har en række kirurgiske komplikationer og reoperation risici3. Således kan brugen af væv-manipuleret spiserøret stilladser efterligne den indfødte spiserøret være en lovende alternativ strategi for i sidste ende regenerere tabt væv4,5,6.
Selv om en væv-manipuleret spiserøret potentielt tilbyder et alternativ til de nuværende behandlinger af esophageal defekter, der er betydelige barrierer for sin in vivo ansøgning. Postoperativ anastomotisk lækage og nekrose af det implanterede esophageal stillads uundgåeligt føre til en dødelig infektion i det omkringliggende aseptiske rum, såsom mediastinum7. Derfor er det yderst vigtigt at forhindre mad eller spyt forurening i såret og nasogastrisk rør. Gastrostomi eller intravenøs ernæring bør overvejes, indtil primær sårheling er afsluttet. Til dato er der udført esophageal vævsteknik i store dyremodeller, fordi store dyr kun kan fodres ved intravenøs hyperalimentation i 2-4 uger efter implantation af stilladset8. En sådan nonoral fodringsmodel er imidlertid ikke blevet etableret for tidlig overlevelse efter esophageal transplantation hos små dyr. Dette skyldes, at dyrene var ekstremt aktive og ukontrollable, så de ikke kunne holde fodring røret i maven i en længere periode. Derfor har der kun været få tilfælde af vellykket esophageal transplantation hos små dyr.
I betragtning af omstændighederne ved esophageal vævsteknik, designede vi en to-lags rørformede stillads bestående af elektrospundet nanofibre (inderlag; Figur 1A) og en 3D-printet streng (ydre lag; Figur 1B), herunder en modificeret gastrostomiteknik. Den interne nanofiber er lavet af PU, en ikke-nedbrydelig polymer, og forhindrer lækage af mad og spyt. De eksterne 3D-printede tråde er lavet af bionedbrydelige polycaprolacton (PCL), som kan give mekanisk fleksibilitet og tilpasse sig peristaltic bevægelse. Menneskelige fedt-afledte mesenkymale stamceller (hAD-MSCs) blev seedet på det indre lag af stilladset til at fremme re-tilnavn. Nanofiberstrukturen kan lette den indledende fornyelse af slimhindeveden ved at give et strukturelt ekstracellulært matrixmiljø (ECM) til cellemigration.
Vi har også øget overlevelsesraten og bioaktiviteten i de podede celler gennem bioreaktordyrkning. Det implanterede stillads var dækket med en skjoldbruskkirtelflap for at muliggøre en mere stabil regenerering af den esophageal slimhinde og muskellag. I denne rapport beskriver vi protokoller for esophageal vævsteknik teknikker, herunder stilladsfremstilling, mesenkymale stamceller-baserede bioreaktor dyrkning, en bypass fodring teknik med modificeret gastrostomi, og en modificeret kirurgisk anastomose teknik til circumferential esophageal rekonstruktion i en rotte model.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksisterende dyreforsøg på kunstig spiserøret er stadig begrænset af flere kritiske faktorer. Den ideelle kunstige esophageal stillads bør være biokompatibel og har fremragende fysiske egenskaber. Det bør være i stand til at regenerere slimhinden epitel i den tidlige postoperative periode for at forhindre anastomotisk lækage. Regenerering af de indre cirkulære og ydre muskellag i længderetningen er også vigtig for funktionel peristalsis12,13.
<p c…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af Korea Health Technology R & U Project gennem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed & Velfærd, Republikken Korea (tilskudnummer: HI16C0362) og Basic Science Research Program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2017R1C1B2011132). De bioprøver og data, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev leveret af Biobank of Seoul National University Hospital, et medlem af Korea Biobank Network.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
Riferimenti
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
