쥐의 원주 식도 재건을 위한 조직 공학 이식편
Summary
식도 재건은 도전적인 절차이며, 식도 점막과 근육의 재생을 가능하게하고 인공 이식으로 이식 할 수있는 조직 공학 식도의 개발이 필요합니다. 여기에서는 스캐폴드 제조, 생물 반응기 재배 및 다양한 수술 기법을 포함한 인공 식도를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
원주 식도 재건을 위한 생체 적합성 물질의 사용은 쥐에서 기술적으로 도전적인 작업이며 영양 지원을 지원하는 최적의 임플란트 기술이 필요합니다. 최근에는 식도 조직 공학에 많은 시도가 있었지만 연석의 특별한 환경에서 초기 상피화의 어려움으로 인해 성공률이 제한되었습니다. 여기서, 우리는 2층 관 성 비계, 중간 엽 줄기 세포 기반 생물 반응기 시스템 및 변형된 바이패스 공급 기술을 통해 식도 점막과 근육 층의 재생을 향상시킬 수 있는 인공 식도를 개발했습니다. 위장관 절제술. 스캐폴드는 외벽을 감싸는 3차원(3D) 인쇄 폴리카프롤락톤 가닥을 가진 원통형 형태의 폴리우레탄(PU) 나노섬유로 이루어진다. 이식에 앞서, 인간 유래 중간엽 줄기 세포를 스캐폴드의 내루에 파종하고, 세포 반응성을 향상시키기 위해 생물반응기 재배를 수행하였다. 우리는 외과 적 해부학을 적용하고 갑상선 플랩으로 이식 된 보철을 덮고 일시적인 비내구 위절제술 을 통해 이식 생존율을 향상시켰습니다. 이 접목은 조직학 분석에 의해 입증된 바와 같이 이식된 부위 의 주위에 초기 상피화 그리고 근육 재생의 사실 인정을 되풀이할 수 있었습니다. 또한, 엘라스틴 섬유 증가 및 혈관 신생은 이식편 주변에서 관찰되었다. 따라서,이 모델은 원주 식도 재건을위한 잠재적 인 새로운 기술을 제시한다.
Introduction
선천성 기형 및 식도 암과 같은 식도 장애의 치료는 식도의 구조적 세그먼트 손실로 이어질 수 있습니다. 대부분의 경우, 위 풀업 도관 또는 결장 간과 같은 자가 대체 이식편이1,2로수행되었습니다. 그러나, 이러한 식도 교체는 다양한 외과적 합병증 및 재수술 위험이3. 따라서, 네이티브 식도를 모방한 조직 공학식도 비계의 사용은 궁극적으로 손실된 조직을 재생하기 위한 유망한 대안 전략이 될 수 있다4,5,6.
조직 공학식도 잠재적으로 식도 결함의 현재 치료에 대 한 대안을 제공 하지만, 그것의 생체 내 응용 프로그램에 대 한 중요 한 장벽이 있다. 이식된 식도 비계의 수술 후 해부학 적 누설 및 괴사는 필연적으로 매질7과같은 주변 무균 공간의 치명적인 감염으로 이어질 수 있습니다. 따라서 상처 및 비위 관의 음식이나 타액 오염을 방지하는 것이 매우 중요합니다. 위장관 절제술 또는 정맥 영양은 1 차적인 상처 치유가 완료될 때까지 고려되어야 합니다. 현재까지, 식도 조직 공학은 큰 동물이 스캐폴드8의이식 후 2-4 주 동안 정맥 과충에 의해서만 공급될 수 있기 때문에 큰 동물 모델에서 수행되었다. 그러나, 이러한 비oral 공급 모델은 작은 동물에서 식도 이식 후 조기 생존을 위해 확립되지 않았다. 이것은 동물이 매우 활동적이고 통제 할 수 없었기 때문에 장기간 동안 수유 튜브를 위장에 보관 할 수 없었기 때문입니다. 이러한 이유로, 작은 동물에 성공적인 식도 이식의 몇 가지 경우가 되었습니다.
식도 조직 공학의 상황을 고려하여, 우리는 전기 스펀 나노 섬유 (내부 층)로 구성된 2 층 관 형 스캐폴드를 설계했습니다. 도 1A)및 3D 프린팅 가닥(외부 층; 도 1B)변형된 위절제술 기법을 포함한다. 내부 나노 섬유는 분해되지 않는 폴리머 인 PU로 만들어졌으며 음식과 타액의 누출을 방지합니다. 외부 3D 프린팅 가닥은 기계적 유연성을 제공하고 연동 운동에 적응할 수 있는 생분해성 폴리카프로롤락톤(PCL)으로 만들어집니다. 인간 지방 유래 중간엽 줄기 세포(hAD-MSCs)는 스캐폴드의 내부 층에 씨를 뿌리고 상피화를 촉진하였다. 나노섬유 구조는 세포 이동을 위한 구조적 세포외 매트릭스(ECM) 환경을 제공함으로써 초기 점막 재생을 용이하게 할 수 있다.
우리는 또한 생물 반응기 재배를 통해 접종 된 세포의 생존율과 생체 활성을 증가시켰습니다. 이식된 스캐폴드는 식도 점막과 근육 층의 보다 안정적인 재생을 가능하게 하기 위해 갑상선 플랩으로 덮여 있었다. 이 보고서에서는 스캐폴드 제조, 중간엽 줄기 세포 기반 생물 반응기 재배, 변형 된 위절제술을 사용한 우회 공급 기술 및 수정 된 수술을 포함한 식도 조직 공학 기술에 대한 프로토콜을 설명합니다. 쥐 모형에 있는 원주 식도 재건을 위한 해부학 기술.
Protocol
Representative Results
Discussion
인공 식도에 기존 동물 연구는 여전히 몇 가지 중요 한 요인에 의해 제한. 이상적인 인공 식도 스캐폴드는 생체 적합성이어야하며 우수한 물리적 특성을 가져야합니다. 그것은 해부학 누설을 방지하기 위해 초기 수술 후 기간에 점막 상피를 재생할 수 있어야합니다. 내측 원형 및 외측 세로 근육층의 재생은 기능연동동동사12,13에도중요하다.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 한국보건산업진흥원(KHIDI)을 통해 한국보건기술R&D 사업지원, 보건복지부(보조금 번호: HI16C0362) 및 기초과학연구 교육부의 지원을 받는 국립연구재단(NRF)을 통한 프로그램(2017R1B2011132). 이 연구에 사용된 생물표본및 데이터는 한국바이오뱅크 네트워크 회원인 서울대학교병원 바이오뱅크가 제공했다.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
Riferimenti
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