Målet med denne protokollen var å utvikle en murine modell av lavt nivå toxicant eksponering som ikke forårsaker åpen leverskade, men heller forverrer pre-eksisterende leverskader. Dette paradigmet bedre viser menneskelig eksponering og subtile endringer som oppstår ved eksponering for toxicant konsentrasjoner som er betraktet som sikre.
Vinyl klorid (VC), en rikelig miljømessige miljøgifter, forårsaker steatohepatitis på høye nivåer, men anses trygt på lavere nivåer. Selv om flere studier har undersøkt rollen som VC som en direkte hepatotoxicant, konseptet at VC endrer følsomheten til leveren til andre faktorer, slik som alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD) forårsaket av høy-fett diett (HFD) er romanen. Denne protokollen beskriver en eksponering paradigme å evaluere effekten av kroniske, lavt nivå eksponering for VC. Mus er acclimated til lav-fett eller høy-fett diett en uke før begynnelsen av innånding eksponering og forblir på disse dietter gjennom hele eksperimentet. Mus er eksponert for VC (sub-OSHA nivå: < 1 ppm) eller rom luft i innånding kamre i 6 timer/dag, 5 dager/uke, i opptil 12 uker. Dyr overvåkes ukentlig for kroppsvektøkning og mat forbruk. Denne modellen av VC eksponering forårsaker ingen åpen leverskade med VC innånding alene. Imidlertid forbedrer kombinasjonen av VC og HFD betydelig leversykdom. En teknisk fordel med denne co-eksponering modellen er hele kroppen eksponering, uten tilbakeholdenhet. Videre, forholdene nærmere ligner en svært vanlig menneskelig situasjon med en kombinert eksponering for VC med underliggende alkoholfrie fatty leversykdom og dermed støtte romanen hypotesen at VC er en miljømessig risikofaktor for utvikling av leverskader som en komplikasjon av fedme (dvs. NAFLD). Dette arbeidet utfordrer paradigmet at gjeldende eksponeringsgrenser VC (yrkesmessig og miljømessig) er trygge. Bruken av denne modellen kan kaste nytt lys og bekymring på risikoen for VC eksponering. Denne modellen av toxicant-indusert leverskade kan brukes til andre flyktige organiske forbindelser og for å studere andre interaksjoner som kan påvirke leveren og andre organsystemer.
Tallrike toxicants er til stede i luften vi puster på svært lave nivåer. Vinyl klorid (VC) er monomere gass som brukes av industrien for å skape polyvinylklorid (PVC) plastprodukter1. Det er en utbredt miljømessig hepatotoxicant, kjent kreftfremkallende, og er rangert #4 på ATSDR farlig stoff prioritet liste2. For bedre å forstå toksiske effekter på menneskers helse og interaksjoner med eksisterende Co-morbidities, etablere modeller av eksponering som etterligner menneskelig eksponering er avgjørende. Den primære interessen for denne gruppen er å studere hepatic effekter av kronisk VC eksponering ved lave konsentrasjoner. VC utøver sine viktigste effekter på leveren, hvor det har blitt vist (ved høye konsentrasjoner) å forårsake steatosis, og toxicant-assosiert steatohepatitis (TASH) med nekrose, fibrose, skrumplever3,4, samt leverkreft (HCC) og den ellers ekstremt sjeldne hepatic hemangiosarcoma5. TASH har trolig eksistert i befolkningen i flere ti år, men forble uncharacterized og underappreciated av etterforskerne4,6. Som et resultat av forskning som viser direkte toksisitet for VC-eksponering, reduserte Occupational Safety and Health Administration (OSHA) den akseptable eksponerings terskelen til 1 ppm over en 8 h arbeidsdag7. Selv om eksponerings terskelen har blitt senket, er effekten av denne konsentrasjonen av VC på menneskers helse uklart7. I tillegg er effekten av VC eksponering på eksisterende komorbiditeter, for eksempel leversykdom, i stor grad ukjent8. Dette kunnskaps gapet er spesielt viktig i dag på grunn av den økende globale utbredelsen av alkoholfrie fatty leversykdom (NALFD)4,6,7,9,10,11,12. Viktigere, VC har nylig vist å være en uavhengig risikofaktor for leversykdom fra andre årsaker13. Målet med denne protokollen var derfor å utvikle en relevant inhalasjons modell for eksponering for flyktige miljømessige toxicant, VC i sammenheng med underliggende leverskade, å etterligne menneskelig eksponering og identifisere potensialet, romanen mekanismer for VC-indusert eller VC-forsterket leverskade.
Den viktigste ruten for eksponering for mange miljømessige toxicants og forurensende stoffer er via innånding. Når inhalert, kan sammensatte gå inn systemisk sirkulasjon gjennom lungene, reise til leveren, og bli metabolically aktiveres av hepatic enzymer før de blir utskilt14,15,16. Det er ofte disse aktive metabolitter som forårsaker toksisitet og skade i kroppen. Tidligere studier av denne gruppen og andre har brukt VC metabolitter som surrogater for eksponering for VC gass17,18. Andre grupper har brukt innånding modeller av VC; Imidlertid ble ekstremt høye eksponeringsnivåer (> 50 ppm) iverksatt for å indusere Akutt toksisitet, alvorlig leverskade og tumor utvikling19. Selv om disse studiene har gitt viktig informasjon og mekanismer for VC-indusert kreftfremkallende, har de ikke recapitulate de subtile effektene og komplekse interaksjoner med andre medvirkende faktorer og derfor er mindre relevante for menneskelig eksponering.
VC-inhalasjon pluss høy fett diett (HFD) modell beskrevet her (se figur 1 for tidslinje), er den første modellen av kronisk, lav dose VC eksponering (dvs. sub-OSHA konsentrasjon), der mus er eksponert for toxicant under forhold som etterligner menneskelig eksponering mye tettere. Faktisk data fra denne modellen sammenfattet resultatene observert hos mennesker eksponert for VC, slik som innvirkning på metabolske trasé20, oksidativt stress og mitokondrie dysfunksjon4. Andre musemodeller av inhalasjon, slik som hode-bare og nese-bare modeller21, krever at dyret skal behersket, forårsaker stress til dyret. Her, denne hele kroppen eksponerings metode ikke krever injeksjon eller unødvendige stress til dyrene. Dyrene ha annonse lib adgang å næringen og vann og er oppstilt innen det større innånding kammeret for en bestemt antallet av timene per dag og dager per uke. Videre konseptet at VC endrer følsomhet for en annen hepatotoxicant er en roman finne, først demonstrert av denne gruppen12 og har IMPLIKASJONER for VC eksponering i konsentrasjoner godt under de som trengs for direkte hepatotoxicity.
Denne metoden for innånding eksponering kan brukes til å etterligne eksponering til en rekke gass toxicants, inkludert andre flyktige organiske forbindelser, til stede i vårt miljø. Faktisk, flyktige organiske forbindelser er en stor gruppe av miljømessige toxicants og mer utbredt i industrialiserte områder, noe som resulterer i visse populasjoner å være i høyere risiko for kronisk eksponering22. Denne protokollen kan endres for å passe ulike eksperimentelle spørsmål. Lengden på tid og konsentrasjon av sammensatte administreres kan varieres. Selv om utgangspunktet utviklet for fastsettelse av leverskade, kan andre organsystemer og har blitt studert med denne modellen23. Etterforskere som mål å studere kroniske eksponeringer med dyr, men ønsker å minimere animalsk stress, bør vurdere å bruke denne modellen.
Denne modellen av VC-forbedret NAFLD er en ny metode for å evaluere effekten av sub-OSHA grense VC eksponering i en hel-kropp innånding paradigme. Denne modellen gjør at etterforskerne å studere sub-hepatotoxic og sensibiliserende effekter av lave nivåer av VC alene. Faktisk, oppnår denne co-eksponering modellen forbedret leverskade, heving av plasma ALAT og AST og moderat betennelse, mens i stor grad ikke påvirker andre organsystemer, som hjerte, ved denne konsentrasjonen23. Denne kroniske modellen krever hele kroppen innånding kamre men minimerer stress og eksponering konsentrasjoner. Selv om protokollen som presenteres her er en Software-drevet tilnærming, har vår erfaring vist at den manuelle tilnærmingen er også en nøyaktig og konsistent metode for eksponering12,24. Videre er det lett tilgjengelig for flere forskningsområder, inkludert andre organskade23 forårsaket av flyktige organiske sammensatte eksponering22. Spesielt, denne modellen kan ligne nærmere på patogenesen av menneskelige co-eksponeringer til miljømessige kjemikalier og underliggende sykdom5.
For å oppnå lignende resultater må det oppnås visse kritiske trinn for protokoll optimalisering. For eksempel må etterforskere fastslå at konsentrasjonen av VC eller andre toxicant innenfor kamrene er innenfor ønsket område av eksponering (dvs. lavt nivå, sub-OSHA, eller akutte nivåer). Optimalisering av dette trinnet i innånding kammeret er avgjørende for en vellykket modell av menneskelig eksponering av interesse. For det andre, justere tidspunktet for eksponering per dag og varighet av eksperimentet kan også endres. Per interessene til denne gruppen, en yrkesmessig eksponering ble oppnådd, og en ekstra parameter for kosthold ble også studert. Imidlertid kan miljømessige og akutte eksponeringer også være modellert med denne protokollen.
Dette arbeidet utfordrer paradigmet som gjeldende eksponeringsgrenser VC (yrkesmessig og miljømessig) er trygge. Faktisk, selv om gjeldende OSHA eksponeringsgrense for VC er 1 ppm, har denne modellen bevist at konsentrasjoner av VC under denne grensen er tilstrekkelig for å forbedre leverskader forårsaket av HFD i mus. Denne protokollen gjør at etterforskerne å studere og karakterisere en roman toxicant eksponering paradigme og modell TASH.
Dette er den første modellen av kronisk, lav dose VC eksponering. Tidligere arbeid brukte svært høye konsentrasjoner av bolus, akutte eksponeringer eller aktive metabolitter som surrogater for VC-eksponering. Alle disse tilnærmingene redusere relevansen av funnene til menneskelig eksponering. Derfor, denne romanen modell av TASH-NAFLD interaksjon gir den nødvendige plattformen for etterforskere å undersøke komplekse interaksjoner av lavt nivå VC eksponering.
Denne modellen av toxicant-indusert leverskade kan brukes til andre flyktige organiske forbindelser og også for å studere andre interaksjoner som kan påvirke leveren og andre organsystemer8,22,23. Videre har denne modellen vært, og kan bli ytterligere, brukes til å undersøke intervensjon terapi og grundig mekanistisk studier av handlings modus for denne utbredte toxicant24. Som VC er en kjent kreftfremkallende26,27,28, denne eksponeringen paradigmet kan også endres for studiet av VC-indusert kreft. Andre Co-morbidities som alkoholholdige leversykdom kan også bli forsterket av VC co-eksponering. I tillegg vil det være av interesse å studere ulike typer fett, for eksempel flerumettede fett18,29,30, eller ulike typer karbohydrater31 og deres co-eksponering med VC i denne modellen. Faktisk, alle disse faktorene er kjent for å ha differensial effekter på utviklingen av leverskade og kan spille en rolle i VC-indusert hepatic sykdom.
Avslutningsvis er dette en roman innånding modell av miljømessige toxicant-indusert leverskade og etablerer en eksponering paradigme for kroniske, lavt nivå VC eksponering. Konsentrasjonen av VC brukes i denne modellen er sub-hepatotoxic av seg selv, mens det forbedrer leverskade forårsaket av en annen faktor (HFD) i mus. Denne modellen vil tillate etterforskere å studere mekanismer og intervensjoner for kroniske VC toksisitet og kan være nyttig for translational studier ser på eksponert menneskelige og på den høyeste risikoen for eksponering.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble finansiert av tildelinger fra National Institutes of Health (K01 DK096042 og R03 DK107912) til Juliane Beier. Forskning ble også støttet av en institusjonell utvikling Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under stipend nummer P20GM113226 og National Institute on Alcohol Abuse og alkoholisme av National Institutes of Health under Award Number P50AA024337. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
ALT/AST reagents | Thermo Fisher | TR70121, TR71121 | |
C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animal studies must conform to all relevant ethics and animal welfare regulations and must be reviewed and approved by the appropriate governmental and institutional animal care and use committees. Since this is a chronic study, we recommend using male or female mice 4-6 weeks of age. |
CO2 Monitor | IEStechno | Ex-Sens | |
Eosin | Sigma | E6003 | |
Hematoxylin | Sigma | HHS16 | |
Inhalation exposure chamber system | IEStechno | GasExpo | The inhalation exposure chamber system includes custom software, interface and controller hubs |
Saturated fat (13%) control diet | Teklad Diets | TD.120336 | |
Saturated fat (42%) diet | Teklad Diets | TD.07511 | |
Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
Vinyl Chloride | MATHESON TRI-GAS | Series 3590-CGA* | Handle gas with caution |