3-आयामी स्फेरॉइड संस्कृतियों से स्टेम जैसी कोशिकाओं का अलगाव
Summary
मानव प्राथमिक प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं का उपयोग करके, हम एक गोलाकार आधारित लेबल-रिटेंशन परख द्वारा स्टेम जैसी कोशिकाओं के कार्यात्मक लक्षण वर्णन की एक उपन्यास बायोमार्कर-मुक्त विधि की रिपोर्ट करते हैं। बीआरडीयू, सीएफएसई, या सुदूर रेड 2डी सेल लेबलिंग के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल वर्णित है; त्रि-आयामी स्फेरॉइड गठन; इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा लेबल-रिटेनिंग स्टेम-लाइक सेल पहचान; और FACS द्वारा अलगाव ।
Abstract
वयस्क स्टेम सेल अनुसंधान में प्रगति के बावजूद, ऊतक नमूनों से स्टेम कोशिकाओं की पहचान और अलगाव एक बड़ी चुनौती बनी हुई है । जबकि निवासी स्टेम सेल वयस्क ऊतकों में आला मजबूरी के साथ अपेक्षाकृत शांत हैं, वे लंगर मुक्त त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति में सेल चक्र में प्रवेश करते हैं और सममित और असममित दोनों कोशिका प्रभाग से गुजरते हैं, जिससे स्टेम और जनक दोनों को जन्म देते हैं कक्षों. उत्तरार्द्ध तेजी से पैदा होता है और वंश प्रतिबद्धता के विभिन्न चरणों में प्रमुख सेल आबादी है, जो विषम स्फेरॉइड बनाते हैं। प्राथमिक सामान्य मानव प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं (HPrEC) का उपयोग करना, एक स्फेरॉइड आधारित, लेबल-प्रतिधारण परख विकसित किया गया था जो एक ही कोशिका संकल्प पर स्फेरॉइड-स्टार्टिंग स्टेम कोशिकाओं की पहचान और कार्यात्मक अलगाव की अनुमति देता है।
HPrEC या सेल लाइनों दो आयामी (2डी) 10 दिनों के लिए BrdU के साथ सुसंस्कृत करने के लिए स्वयं सहित सभी विभाजन कोशिकाओं के डीएनए में अपने निगमन की अनुमति है स्टेम सेल नवीनीकरण । धोना 5 दिनों के लिए 3 डी संस्कृति में स्थानांतरित होने पर शुरू होता है, जिसके दौरान स्टेम सेल असममित विभाजन के माध्यम से स्वयं-नवीनीकृत होते हैं और स्फेरॉइड गठन शुरू करते हैं। जबकि अपेक्षाकृत शांत बेटी स्टेम सेल BrdU लेबल माता पिता के डीएनए बनाए रखने, बेटी जनक तेजी से पैदा, BrdU लेबल खोने । बीआरडीयू को सीएफएसई या सुदूर लाल समर्थक रंगों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जो FACS द्वारा लाइव स्टेम सेल अलगाव की अनुमति देते हैं। स्टेम सेल विशेषताओं इन विट्रो स्फेरॉइड गठन द्वारा पुष्टि कर रहे हैं, वीवो ऊतक उत्थान परख में, और उनके सममित/असममित सेल डिवीजनों का दस्तावेजीकरण करके । अलग लेबल को बनाए रखने स्टेम सेल कड़ाई से आरएनए-सीक्यू, ChIP-seq, एकल सेल पर कब्जा, मेटाबोलिक गतिविधि, प्रोटेम प्रोफाइलिंग, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, ऑर्गेनॉइड गठन, और वीवो ऊतक उत्थान में शामिल द्वारा कड़ाई से पूछताछ की जा सकती है । महत्वपूर्ण बात, इस मार्कर मुक्त कार्यात्मक स्टेम सेल अलगाव दृष्टिकोण ताजा कैंसर के नमूनों और कई अंगों से कैंसर सेल लाइनों से स्टेम की तरह कोशिकाओं की पहचान करता है, व्यापक प्रयोज्यता का सुझाव । यह कैंसर स्टेम की तरह सेल बायोमार्कर की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कैंसर स्टेम की तरह कोशिकाओं को लक्षित स्क्रीन फार्मास्यूटिकल्स, और कैंसर में उपंयास चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज ।
Introduction
मानव प्रोस्टेट ग्रंथि में गुप्त कार्य और बेसल कोशिकाओं के साथ चमकदार एपिथेलियम होता है जो इसे एक असामान्य न्यूरोएंडोक्राइन सेल घटक के साथ अंतर्निहित करता है। इस मामले में एपिथेलियल कोशिकाएं प्रोस्टेट स्टेम कोशिकाओं की एक दुर्लभ आबादी से उत्पन्न होती हैं जो वीवो में अपेक्षाकृत शांत होती हैं और पूरे जीवन में ग्रंथि होमोस्टोसिस बनाए रखने के लिए मरम्मत प्रणाली के रूप में कार्य करती हैं1। कई अग्रिमों के बावजूद, प्रोस्टेट स्टेम कोशिकाओं की पहचान और कार्यात्मक अलगाव क्षेत्र में एक बड़ी चुनौती बनी हुई है । स्टेम सेल बायोमार्कर, जिसमें सेल सरफेस मार्कर-आधारित पद्धतियों को प्रवाह साइटोमेट्री के साथ जोड़ा जाता है, आमतौर पर स्टेम सेल रिसर्च2,3,4के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, संवर्धन और अलगाव के परिणाम मार्कर संयोजन और एंटीबॉडी विशिष्टता5,6के एक समारोह के रूप में व्यापक रूप से भिन्न होतेहैं,जो अलग-थलग कोशिकाओं की पहचान के बारे में सवाल उठाते हैं। स्टेम-जैसे सेल संवर्धन के लिए एक और व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण त्रि-आयामी (3 डी) स्फेरॉइड संस्कृति2,3,4है। जबकि निवासी स्टेम सेल आला मजबूरी के साथ वीवो में अपेक्षाकृत शांत होते हैं, वे 3 डी मैट्रिक्स संस्कृति (सममित और असममित दोनों) में सेल डिवीजन से गुजरते हैं, जो स्टेम और जनक कोशिकाओं दोनों का उत्पादन करते हैं जो तेजी से वंश प्रतिबद्धता7,8की ओर पुन: पेश करते हैं। गठित स्फेरॉइड एक विषम मिश्रण हैं जिसमें वंश प्रतिबद्धता के विभिन्न चरणों में स्टेम सेल और जनक कोशिकाएं दोनों होती हैं, जिनमें प्रारंभिक और देर से चरण जनक कोशिकाएं शामिल हैं। इस प्रकार, पूरे स्फेरॉइड का उपयोग कर के परख स्टेम सेल अनन्य नहीं हैं, जिससे अद्वितीय स्टेम सेल गुणों की पहचान बेनतीजा हो जाती है। इसलिए, अपनी बेटी के जनकों से प्रोस्टेट स्टेम सेल की पहचान करने और अलग करने के लिए परख बनाना महत्वपूर्ण है। इस दिशा में, वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक परख प्रणाली स्थापित करना है जो मानव प्रोस्टेट ऊतकों से स्टेम कोशिकाओं की कुशल पहचान और अलगाव के लिए अनुमति देता है जिसके बाद उनके जैविक कार्यों का मजबूत डाउनस्ट्रीम विश्लेषण होता है।
लंबे समय तक 5-ब्रोमो-2′-डिऑक्सीरिडीन (बीआरडीयू) लेबल-रिटेंशन का व्यापक रूप से वीवो में और स्टेम सेल के इन विट्रो वंश ट्रेसिंग के लिए उपयोग किया जाता है, जो उनके लंबे समय तक दोहरीकरण समय9,10के आधार पर है। प्रोस्टेट स्टेम सेल पहचान और अलगाव के लिए वर्तमान दृष्टिकोण यहां वर्णित एक मिश्रित एपिथेलियल आबादी के भीतर उनके सापेक्ष शांत विशेषता और लेबल प्रतिधारण गुणों पर आधारित है । इसके अलावा, अमर कतरा डीएनए परिकल्पना के आधार पर, केवल स्टेम सेल असममित सेल डिवीजन से गुजरना कर सकते हैं । स्टेम सेल बेटी सेल का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें पुराने माता-पिता का डीएनए होता है जबकि जनक कोशिका, जो एक प्रतिबद्ध बेटी कोशिका है, नए संश्लेषित डीएनए प्राप्त करती है । ऊपर वर्णित अद्वितीय स्टेम सेल संपत्ति प्राथमिक संस्कृतियों में माता पिता स्टेम सेल में BrdU लेबलिंग प्रदर्शन करने के लिए शोषण किया है और फिर 3 डी लंगर मुक्त स्तोलेरॉइड संस्कृति के लिए हस्तांतरण पर BrdU-washout के बाद अपने लेबल को ट्रैक । जबकि प्राथमिक प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं के बहुमत 2 डी संस्कृति में एक बेसल और पारगमन बढ़ाना phenotype बनाए रखने, वहां भी बहुशक्तिशाली स्टेम कोशिकाओं की भरपाई और विशेषण homeostasis के रूप में गोलाकार होमोस्टोसिस के गठन के रूप में प्रस्पेरोइड या पूरी तरह से विभेदित ऑर्गेनोइड के गठन के द्वारा सबूत की एक दुर्लभ आबादी है 3 डी सिस्टम3,12को हस्तांतरण पर इसी संस्कृति मीडिया के साथ । हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल में, HPrEC प्रोस्टेट स्फेरॉइड या प्रोस्तास्फीयर आधारित BrdU, CFSE, या सुदूर लाल प्रतिधारण परख ों का उपयोग करके फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के बाद, हम एक एकल सेल स्तर13पर स्फेरॉइड में लेबल बनाए रखने स्टेम कोशिकाओं की पहचान करते हैं ।
महत्वपूर्ण बात, हमने वंश प्रतिबद्धता के साथ जनक कोशिकाओं की तुलना में प्रारंभिक चरण के स्फेरॉइड के भीतर लेबल-रिटेनिंग कोशिकाओं की स्टेम सेल विशेषताओं की पुष्टि की। इनमें स्टेम सेल असममित विभाजन, इन विट्रो स्फेरॉइड गठन क्षमता और वीवो ऊतक पुनर्जनन क्षमता, ऊंचा ऑटोफैगी गतिविधि, संवर्धित राइबोसोम बायोजेनेसिस और मेटाबोलिक गतिविधि में कमी शामिल है। बाद में, RNAseq विश्लेषण किया गया था। लेबल-रिटेनिंग स्फेरॉइड कोशिकाओं में विभेदित रूप से व्यक्त किए गए जीन देखे गए जो मानव प्रोस्टेट स्टेम कोशिकाओं के लिए उपन्यास बायोमार्कर के रूप में काम कर सकते हैं। यह स्फेरॉइड आधारित लेबल-रिटेनिंग दृष्टिकोण कैंसर के नमूनों पर लागू हो सकता है ताकि इसी तरह कैंसर स्टेम जैसी कोशिकाओं की एक छोटी संख्या की पहचान की जा सके, इस प्रकार चिकित्सकीय प्रतिरोधी आबादी13का प्रबंधन करने के लिए अनुवाद के अवसर प्रदान किए जा सकते हैं । नीचे प्रस्तुत एक उदाहरण के रूप में मानव प्राथमिक प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं (HPrEC) का उपयोग कर प्रोस्तास्फीयर आधारित लेबल-प्रतिधारण परख है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मल्टीपल स्टेम सेल सरफेस मार्कर का उपयोग करने वाली फ्लो साइटोमेट्री विशिष्टता और चयनात्मकतादोनोंकी कमी के बावजूद स्टेम सेल अनुसंधान के लिए आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण है 1,<sup c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान R01-CA172220 (जीएसपी, WYH), R01-ES02207 (जीएसपी, WYH) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । हम सेल छंटाई पर सहायता के लिए शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में फ्लो साइटोमेट्री कोर का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
Riferimenti
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