Isolering av Stem-liknande celler från 3-dimensionella sfäroid kulturer
Summary
Med hjälp av mänskliga primära prostataepitelceller, rapporterar vi en ny biomarker-fri metod för funktionell karakterisering av stamceller med en sfäroid-baserade etikett-retention assay. Ett steg-för-steg-protokoll beskrivs för BrdU, CFSE eller långt röd 2D-cellmärkning; tredimensionell sfäroid formation; etikett-behålla Stem-liknande cell identifiering av immunocytochemistry; och isolering av FACS.
Abstract
Trots framsteg inom forskning om adulta stamceller är identifiering och isolering av stamceller från vävnadsprov fortfarande en stor utmaning. Medan inhemska stamceller är relativt quiescent med nisch begränsningar i vuxna vävnader, de går in i cellcykeln i ankare-fri tredimensionell (3D) kultur och genomgår både symmetriska och asymmetriska celldelning, vilket ger upphov till både Stem och stamcells Celler. Den senare sprider sig snabbt och är den stora cellpopulationen i olika stadier av härstamnings åtagande, som bildar heterogena spheroids. Med hjälp av primära normala mänskliga prostataepitelceller (HPrEC), en spheroid-baserade, etikett-retention assay utvecklades som möjliggör identifiering och funktionell isolering av sfäroid-initiera stamceller vid en enda cell upplösning.
HPrEC eller cellinjer är två-dimensionellt (2D) odlade med BrdU i 10 dagar för att tillåta dess införlivande i DNA av alla delnings celler, inklusive självförnyande stamceller. Tvätta ur inleds vid överföring till 3D-kulturen i 5 dagar, under vilken stamceller själv förnya genom asymmetrisk Division och initiera sfäroid formation. Medan relativt quiescent dotter stamceller behåller BrdU-märkt föräldra-DNA, dotter föräldraparets snabbt förökat, förlorar BrdU etiketten. BrdU kan ersättas med CFSE eller långt rött Pro-färgämnen, som tillåter levande stamcells isolering av FACS. Stamcells egenskaper bekräftas av in vitro-sfäroid formation, in vivo vävnad förnyelse analyser, och genom att dokumentera deras symmetriska/asymmetriska cell divisioner. Den isolerade etikett-behålla stamceller kan noggrant förhöras av nedströms molekylära och biologiska studier, inklusive RNA-SEQ, ChIP-SEQ, Single cell Capture, metabolisk aktivitet, proteomet profilering, immunocytokemi, Organoid formation, och in vivo vävnad förnyelse. Viktigt, denna markör-fri funktionell stamcells isolering metod identifierar Stem-liknande celler från färska cancer preparat och cancer cellinjer från flera organ, vilket tyder på bred tillämplighet. Det kan användas för att identifiera cancer Stem-liknande cell biomarkörer, Screen Pharmaceuticals inriktning cancer Stem-liknande celler, och upptäcka nya terapeutiska mål i cancer.
Introduction
Den mänskliga prostatakörteln innehåller luminala epitel med sekretoriska funktion och basal celler underliggande det tillsammans med en ovanlig neuroendokrina cell komponent. De epitelceller, i detta fall, genereras från en sällsynt population av prostata stamceller som är relativt quiescent in vivo och fungera som ett reparationssystem för att upprätthålla körtel homeostas hela livet1. Trots många framsteg är identifieringen och funktionell isolering av prostata stamceller fortfarande en stor utmaning på området. Stamcells biomarkörer, inklusive cellytmarkeringsbaserade metoder kombinerat med flödescytometri används ofta för stamcellsforskning2,3,4. Resultaten för berikning och isolering varierar dock mycket som en funktion av markör kombinationer och antikropps specificitet5,6, vilket väcker frågor om de isolerade cellernas identitet. En annan allmänt använd metod för stamliknande cell berikning är tredimensionell (3D) sfäroid kultur2,3,4. Medan inhemska stamceller är relativt quiescent in vivo med nisch begränsningar, de genomgår celldelning i 3D Matrix kultur (både symmetriska och asymmetriska), genererar både stamceller och progenitorceller som snabbt föröka sig mot härstamnings åtagandet7,8. De bildade sfäoiderna är en heterogen blandning som innehåller både stamceller och progenitorceller i olika stadier av härstamnings åtagande, inklusive tidiga och sena Stadium stamceller. Således, analyser med hjälp av hela spheroids är inte stamcells exklusiva, vilket gör identifieringen av unika stamceller egenskaper ofullständiga. Därför är det viktigt att skapa analyser för att identifiera och separera stamceller från deras dotter progenitorer. I detta syfte är målet med det nuvarande protokollet att upprätta ett analyssystem som möjliggör effektiv identifiering och isolering av stamceller från mänskliga prostata vävnader följt av en robust analys av deras biologiska funktioner i senare led.
Långsiktig 5-Bromo-2 ‘-deoxyuridine (BrdU) etikett-retention används ofta för in vivo och in vitro-linjen spårning av stamceller baserat på deras förlängda fördubblings tid9,10. Den nuvarande metoden för identifiering och isolering av prostata stamceller är baserad på deras relativa quiescent karakteristiska och etikett-retention egenskaper inom en blandad epitelial population. Dessutom, baserat på den odödliga strand DNA-hypotesen, kan endast stamceller genomgå asymmetrisk celldelning. Stamcellen representerar den dotter cell som innehåller den äldre föräldra-DNA medan stamcells cellen, som är en engagerad dotter cell, tar emot den nyligen syntetiserade DNA. Den unika stamcells egendom som beskrivs ovan utnyttjas för att utföra BrdU märkning i föräldra stamceller i primära kulturer och sedan spåra deras etikett efter BrdU-washout vid överföring till 3D ankare-fri sfäroid kultur. Medan majoriteten av primära prostata epitelceller behålla en basal och transit förstärkning fenotyp i 2D-kultur, det finns också en sällsynt population av multipotenta stamceller påfyllning och bibehålla epitelial homeostas som framgår av bildandet av sfätrooider eller helt differentierade organoider med motsvarande kultur media vid överföring till 3D-system3,12. I vårt nuvarande protokoll, genom att använda hprec prostata spheroids eller prostasphere-baserade BrdU, cfse, eller far Red retention analyser följt av fluorescens aktiverad cell sortering (FACS), identifierar vi etikett-behålla stamceller i spheroids på en enda cellnivå13.
Viktigt, vi bekräftade ytterligare stamcells egenskaperna hos etikett-behålla celler inom tidigt skede spheroids jämfört med stamceller med härstamning engagemang. Dessa inkluderar stamceller asymmetrisk Division, in vitro-sfäroid formation förmåga och in vivo vävnad regenereringskapacitet, förhöjd autofagi aktivitet, förstärkt ribosombiogenes och minskad metabolisk aktivitet. Därefter utfördes RNAseq-analys. Differentiellt uttryckt gener i etikett-behålla sfäroid celler observerades som kan fungera som nya biomarkörer för mänskliga prostata stamceller. Detta spheroid-baserade etikett-behålla tillvägagångssätt kan gälla för cancer preparat att på liknande sätt identifiera ett litet antal cancer Stem-liknande celler, vilket ger translationella möjligheter att hantera de terapeutiska resistenta populationer13. Presenteras nedan är prostasphere-baserade etikett-retention analys med hjälp av mänskliga primära prostataepitelceller (HPrEC) som ett exempel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flödescytometri med flera stamcells markörer är en vanlig metod för stamcellsforskning, trots att den saknar både specificitet och selektivitet1,5,6. Medan sfäroid formation i ett 3D-kultur system är en annan användbar metod för att berika den sällsynta stamceller befolkningen från primära epitelceller, inklusive hprec, de resulterande sfäroid är fortfarande en heterogen blandning av stamceller och stamfader celler…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från National Cancer Institute R01-CA172220 (GSP, WYH), R01-ES02207 (GSP, WYH). Vi tackar Flow Cytometry Core vid University of Illinois i Chicago för hjälp med cell sortering.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 1 mL tuberculin syringes | Bectin Dickinson | BD 309625 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes, sterile | |||
| 100 mm culture dishes | Corning/Falcon | 353003 | |
| 12-well culture plate | Corning/Falcon | 353043 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352097 | |
| 22 x 22 mm coverslips, sq | Corning | 284522 | For MatTek 35 mm culture dish |
| 24 x 50 mm coverslips | Corning | 2975245 | |
| 26G x 1.5 inch hypodermic needle | Monoject | 1188826112 | |
| 2N HCl | |||
| 35 mm culture dish with cover glass bottom | MatTek Corp | P35G-0-10-C | Glass bottom No. 0, uncoated,  irradiated |
| 40 µm pore nylon cell strainer | Corning | 352340 | |
| 5% CO2 culture incubator, 37 °C | Forma | ||
| 50 mL centrifuge tubes | Corning/Falcon | 352098 | |
| 5mL Polystyrene Round-Bottom Tube with strainer snap cap | Corning | 352235 | 35 µm nylon mesh |
| 6-well culture plates | Corning | 353046 | |
| 8-well chamber slides | Millipore Sigma | PEZGS0816 | |
| Aqueous mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | A nuclear fluorescent dye |
| Biological safety cabinet, Level 2 certified | |||
| BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridine) | Sigma-Aldrich | B5002 | 1 mM stock solution in DMSO |
| Centrifuge for 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
| Centrifuge for 15 mL tubes | Beckman Coulter | Allegra 6 | |
| CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) | Thermo Fisher Scientific | C34554 | 5 mM stock solution in DMSO |
| cytochalasin D | Thermo Fisher Scientific | PHZ1063 | |
| Dispase 1U/mL | StemCell Technologies | 07923 | |
| FACS CellSorter MoFlo XDP | Beckman Coulter | s | |
| Far-Red pro-dye | Thermo Fisher | C34564 | 5 mM stock solution in DMSO |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | For coating 100 mm culture dishes |
| Fluorescent microscope with color digital camera | Carl Zeiss | Axioskop 20 fluorescent microscope; color digital Axiocamera | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11029 | |
| HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells) | Lifeline Cell Technology | FC-0038 | Pooled from 3 young (19-21yr od) disease-free organ donors; 1 x 105 cells/mL; stored in liquid nitrogen |
| ice bucket and ice | |||
| Inverted microsope with digital camera | |||
| Matrigel, low growth factor, phenol-red free | Corning | 356239 | |
| Methanol | Corning | A452-4 | |
| Mouse anti-BrdU antibody | Cell Signaling | 5292S | |
| Mouse IgG antibody (negative control) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pipettors and tips, various sizes | |||
| PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium) | Lifeline Cell Technology | LL-0041 | |
| Propidium Iodide (PI) | R & D Systems | 5135/10 | 10 μg/mL PI in PBS stored at 4 °C in the dark |
| Serological pipets, various sizes | |||
| Software for sphere counting and size measurements | |||
| Software: 3D images using Imaris an imageing software with freeform drawing capabilities | |||
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Water bath, 37 °C | |||
| z-stack images using a transmitted light inverted fluorescent confocal microscope |
Riferimenti
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single cell. Nature. 456, 804-808 (2008).
- Xin, L., Lukacs, R. U., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Self-renewal and multilineage differentiation in vitro from murine prostate stem cells. Stem Cells. 25, 2760-2769 (2007).
- Hu, W. Y., et al. Estrogen-initiated transformation of prostate epithelium derived from normal human prostate stem-progenitor cells. Endocrinology. 152, 2150-2163 (2011).
- Hu, W. Y., Shi, G. B., Hu, D. P., Nelles, J. L., Prins, G. S. Actions of endocrine disrupting chemicals on human prostate stem/progenitor cells and prostate cancer risk. Molecular and Cellular Endocrinology. 354, 63-73 (2012).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Ricerca sul cancro. 65, 10946-10951 (2005).
- Vander Griend, D. J., et al. The role of CD133 in normal human prostate stem cells and malignant cancer-initiating cells. Ricerca sul cancro. 68, 9703-9711 (2008).
- Wang, J., et al. Symmetrical and asymmetrical division analysis provides evidence for a hierarchy of prostate epithelial cell lineages. Nature Communications. 5, 4758 (2014).
- Neumuller, R. A., Knoblich, J. A. Dividing cellular asymmetry: asymmetric cell division and its implications for stem cells and cancer. Genes and Development. 23, 2675-2699 (2009).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138, 1083-1095 (2009).
- Klein, A. M., Simons, B. D. Universal patterns of stem cell fate in cycling adult tissues. Development. 138, 3103-3111 (2011).
- Cairns, J. Mutation selection and the natural history of cancer. Nature. 255, 197-200 (1975).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159, 163-175 (2014).
- Hu, W. Y., et al. Isolation and functional interrogation of adult human prostate epithelial cells at single cell resolution. Stem Cell Research. 23, 1-12 (2017).
- Bryant, D. M., Stow, J. L. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends in Cell Biology. 14, 427-434 (2004).
- Clevers, H., Loh, K. M., Nusse, R. Stem cell signaling. An integral program for tissue renewal and regeneration: Wnt signaling and stem cell control. Science. 346, 1248012 (2014).
- Madueke, I., et al. The role of WNT10B in normal prostate gland development and prostate cancer. The Prostate. 79 (14), 1692-1704 (2019).
- Guan, J. L., et al. Autophagy in stem cells. Autophagy. 9, 830-849 (2013).
