Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën

Summary

Mycobacterium tuberculose vertoont een verhoogde productie en afgifte van extracellulaire blaasjes als reactie op lage ijzer omstandigheden. Dit werk Details een protocol voor het genereren van lage ijzer omstandigheden en methoden voor de zuivering en karakterisering van mycobacteriële extracellulaire blaasjes vrijgegeven in reactie op ijzertekort.

Abstract

Mycobacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculose (MTB), de veroorzaker van humane tuberculose, brengen natuurlijke extracellulaire blaasjes (ev’s) met immunologisch actieve moleculen vrij. Kennis over de moleculaire mechanismen van blaasje biogenese, de inhoud van de blaasjes, en hun functies op de pathogeen-hostinterface is zeer beperkt. Het aanpakken van deze vragen vergt strenge procedures voor isolatie, zuivering en validering van Ev’s. Eerder bleek de productie van blaasje te worden verbeterd toen M. tuberculose werd blootgesteld aan ijzer beperking, een aandoening die door MTB in de hostomgeving wordt ondervonden. Hier gepresenteerd is een compleet en gedetailleerd protocol om Ev’s te isoleren en te zuiveren van ijzer deficiënte mycobacteriën. Er worden kwantitatieve en kwalitatieve methoden toegepast om gezuiverde Ev’s te valideren.

Introduction

Mycobacteriële extracellulaire blaasjes (mev’s) zijn membraan gebonden nanodeeltjes, 60 − 300 nm in grootte, natuurlijk vrijgegeven door snel-en langzaam groeiende mycobacteriën¹. Mev’s vrijgegeven door pathogene mycobacteriën vormen een mechanisme om te communiceren met de gastheer via immunologisch actieve eiwitten, lipiden, en glycolipiden uitgescheiden in een geconcentreerde en beschermde manier^2,3,4. Om mevs te karakteriseren en hun biogenese en functies te begrijpen, zijn strikte en efficiënte methoden voor het zuiveren en valideren van blaasje cruciaal. Tot nu toe zijn mev’s geïsoleerd van de cultuur filtraten van mycobacteriën geteeld in een ijzerrijke medium^1,5,6,7,8.

Echter, vorig werk toonde aan dat ijzer beperking sterk stimuleert blaasje vrijlating in MTB, mogelijk om ijzer vast te leggen via mycobactin, een siderophore uitgescheiden in mevs⁹. Hoewel er een beschrijving is gegeven van de procedures voor Mev’s die geïsoleerd zijn van MTB-culturen in een hoog ijzer medium, is er geen efficiënte methodologie gerapporteerd voor het verkrijgen van Mev’s uit een laag ijzergehalte. Daarom is het doel van deze methode het isoleren, zuiveren en kwantificeren van mev’s die zijn verkregen uit lage ijzer culturen, zodat ze kunnen worden gebruikt voor biochemische en functionele testen en voor de analyse van genetische determinanten van blaasje productie in mycobacteriën.

Protocol

1. bereiding van met ijzer uitgeput gedefinieerd medium Bereid 1 L minimaal medium (MM) door het oplossen van 5 g KH2po4, 5 g L-Asparagine, 20 ml glycerol en 2 g dextrose in 900 ml gedeïoniseerd water in een plastic container. Vermijd glas om ijzer verontreiniging te voorkomen. Pas de pH op 6,8 met 5 N NaOH en het volume op 1 L met water. Voeg 50 g metaal chelaat hars (MCR) toe en roer voorzichtig met een magnetische roer stang gedurende 24 uur bij 4 °C. Steriliseren en verwijd…

Representative Results

Mev’s werden gezuiverd door differentiële sedimentatie in een dichtheidsgradiënt (Figuur 1, Figuur 2). Onder de beschreven omstandigheden scheidden Mev’s meestal in gradiënt breuk 3 (F3), wat overeenkomt met 25% iodixanol. Deze conclusie is gebaseerd op de detectie van eiwitten, membraan lipide, microscopische visualisatie van intact MEVs, nanodeeltjes grootteverdeling, en positieve reactiviteit met een antivesicle antiserum (…

Discussion

Er zijn meerdere methoden ontwikkeld voor het zuiveren van eukaryote celafgeleide exosomen¹². Er is daarentegen beperkte informatie beschikbaar over effectieve methoden voor het zuiveren van door bacteriën afgeleide Ev’s⁷. Efficiënte isolatie van Ev’s met MTB-derivaten moet rekening houden met de intrinsieke moeilijkheden bij het kweken van deze pathogene Mycobacterium. MTB heeft een lange delings tijd (~ 24 uur) en moet worden behandeld in de bioveiligheid niveau drie (B…

Materials

Amicon stirred cell Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes	Fisher	05-538-61	Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane	EMD Milipore	PBHK07610	Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin	Bio-Rad	142-2842	Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310	Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane	GE Healthcare	10600001	Blotting Membrane
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm	Beckman Coulter	344059	Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye	BioRad	5000006	Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S12000	Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH	Molecular Probes	T204	1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks	CellPro	V50022	Filter Unit