Isolering og karakterisering av ekstracellulære blemmer produsert av Iron-Limited mykobakterier

Summary

Mycobacterium tuberkulose viser økt produksjon og frigjøring av ekstracellulære blemmer som svar på lave jern forhold. Dette arbeidet detaljer en protokoll for generering av lave jern forhold og metoder for rensing og karakterisering av mykobakterieinfeksjoner ekstracellulære blemmer utgitt som svar på jernmangel.

Abstract

Mykobakterier, inkludert Mycobacterium tuberkulose (MTB), den utløsende Agent for menneskelig tuberkulose, naturlig utgivelse ekstracellulære blemmer (EV) som inneholder immunologisk aktive molekyler. Kunnskap om molekylære mekanismer av vesicle kognitiv, innholdet av blemmer, og deres funksjoner på patogen-vert grensesnittet er svært begrenset. Å ta opp disse spørsmålene krever strenge prosedyrer for isolering, rensing og validering av EV ‘ r. Tidligere ble det funnet vesicle produksjon som ble forsterket da M. tuberkulose ble utsatt for jern begrensning, en tilstand som ble oppdaget av MTB i vertsmiljøet. Her presenteres en komplett og detaljert protokoll for å isolere og rense EV ‘ r fra jern mangelfull mykobakterier. Kvantitative og kvalitative metoder brukes for å validere renset EV ‘ r.

Introduction

Mykobakterieinfeksjoner ekstracellulære blemmer (Model) er membran bundne nanopartikler, 60 − 300 NM i størrelse, naturlig utgitt av hurtig-og sakte voksende mykobakterier¹. Model utgitt av patogene mykobakterier utgjør en mekanisme for å samhandle med verten via immunologisk aktive proteiner, lipider, og glykolipider skilles ut i en konsentrert og beskyttet måte^2,3,4. Å karakterisere Model og oppfatte deres kognitiv og funksjonene, streng og effektiv metoder av vesicle rensing og godkjenningen er avgjørende. Hittil har Model blitt isolert fra kulturen filtrates av mykobakterier vokst i en jern-rik medium^1,5,6,7,8.

Men tidligere arbeid demonstrerte at jern begrensning sterkt stimulerer vesicle utgivelse i MTB, muligens for å fange jern via mycobactin, en siderophore utskilles i Model⁹. Selv om prosedyrer for Model isolasjon fra MTB kultivert i høyt jern medium har blitt beskrevet, en effektiv metodikk for å få Model fra lav jern kulturer har ikke blitt rapportert. Derfor er målet med denne metoden å isolere, rense og kvantifisere Model innhentet fra lav jern kulturer slik at de kan brukes til biokjemiske og funksjonelle analyser og for analyse av genetiske faktorer for vesicle produksjon i mykobakterier.

Protocol

1. utarbeidelse av jern-utarmet definert medium Forbered 1 L av minimal medium (MM) ved å oppløse 5 g av KH2PO4,5g av L-asparagin, 20 ml glyserol og 2 g druesukker i 900 ml deionisert vann i en plastbeholder. Unngå glass for å hindre jern forurensning. Juster pH til 6,8 med 5 N NaOH og volumet til 1 L med vann. Tilsett 50 g metall chelaterande harpiks (MCR) og forsiktig agitere ved hjelp av en magnetisk røre bar i 24 timer ved 4 ° c. Sterilisere og fjern MCR ved filtrering …

Representative Results

Model ble renset ved differensial sedimentering i en tetthet gradient (figur 1, figur 2). Under forholdene beskrevet, Model separert det meste i gradient brøkdel 3 (F3), som tilsvarer 25% iodixanol. Denne konklusjonen er basert på påvisning av protein, membran lipid, mikroskopisk visualisering av intakt Model, nanopartikkel størrelsesfordeling, og positiv reaktivitet med en antivesicle antiserum (figur 2<…

Discussion

Flere metoder for å rense eukaryote celle-avledet exosomes har blitt utviklet¹². I kontrast er det begrenset informasjon om effektive metoder for å rense bakterier-avledet EV⁷. Effektiv isolering av MTB-avledet EV ‘ r må vurdere de iboende vanskelighetene med å dyrke denne patogene Mycobacterium. MTB har en lang divisjon tid (~ 24 h) og bør håndteres i biosafety nivå tre (BSL-3) forhold. Derfor er det viktig å optimalisere effektiviteten av MEV isolasjons metoder. F…

Materials

Amicon stirred cell Model 108	EMD Milipore	UFSC40001	Cell Ultrafiltration system
BD Polypropilene 225 ml conical tubes	Fisher	05-538-61	Conical centrifuge tubes
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane	EMD Milipore	PBHK07610	Ultrafiltration membrane
Chelex-100 resin	Bio-Rad	142-2842	Metal chelating resin
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mycobacterial Agar plates
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310	Mycobacterial broth medium
Nitro cellulose blotting membrane	GE Healthcare	10600001	Blotting Membrane
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm	Beckman Coulter	355618	Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm	Beckman Coulter	344059	Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm
Protein Assay dye	BioRad	5000006	Bradford Protein Staining
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S12000	Ultrasensitive protein stain
TMA-DPH	Molecular Probes	T204	1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate
Vacuum filtration flasks	CellPro	V50022	Filter Unit