微卫星DNA基因分型和流细胞学比较分析形式固定石蜡嵌入水合体摩尔组织
Summary
水合体摩尔是异常的人类怀孕与异质的异质性，可以根据其形态特征和父母对摩尔基因组的贡献进行分类。本文详细介绍了多路微卫星DNA基因分型和形式固定石蜡嵌入摩尔组织的流式细胞测定方案，以及结果的解释和集成。
Abstract
水合体摩尔（HM）是一种异常的人类妊娠，其特征是营养性过度增殖和胚胎发育异常。有两种类型的HM基于微观形态学评估，完整的HM（CHM）和部分HM（PHM）。这些可以根据父母对摩尔基因组的贡献进一步细分。通过形态学和基因型分析，HM的这种特征对于患者管理和对这种有趣的病理学的基本理解至关重要。据大量记录，HM 的形态分析受到广泛的观察者间变异性的影响，本身不足以准确分类 HM 到 CHM 和 PHM，并将其与水性非摩尔流产区分开来。基因分型分析主要针对受孕的正规固定石蜡嵌入（FFPE）产物的DNA和组织，其质量低于最佳质量，因此可能导致错误的结论。本文提供了FFPE摩尔组织的多路基因分型和流细胞学分析的详细方案，以及这些方法结果的解释、故障排除和与形态评估的集成，p57KIP2免疫组织化学，荧光原位杂交（FISH）达到正确可靠的诊断。在这里，作者分享了过去10年从大约400种受孕产物的分析中学到的方法和教训。
Introduction
水合体摩尔（HM）是一种异常的人类妊娠，其特征是胚胎发育异常、营养素增殖和胆汁性分裂（CV）的水分退化。从历史上看，HM过去分为两种类型，即完全HM（CHM）和部分HM（PHM），仅基于形态学评估1。然而，已经表明，仅仅形态学评估不足以将HM分类为两个亚型（CHM和PHM），并将其与非摩尔流产2、3、4区分开来。
由于 CHM 和 PHM 具有不同的恶性肿瘤倾向，因此必须准确确定 HM 的基因性类型，以便为患者提供适当的随访和管理。因此，在过去几十年中，为了确定父母对摩尔组织的贡献，并得出正确的HM分类，已经制定并发展了几种方法。其中包括核糖核代分析、染色体带状多态性、人类白细胞抗原（HLA）血清类型、限制片段长度多态性、可变串联重复数、微卫星基因分型、流动细胞学和p57KIP2免疫性化学。这允许根据父母对其基因组的贡献对HM概念进行准确的细分，如下所示：CHM，这是双倍体和共生单精子或双倍体和共基因破坏，和PHM，这是三倍体，在99%和在1%的病例中，单精子5，6，7，8。此外，在过去二十年中出现了另一种基因性类型的HM，即双亲双亲。后者大多反复发生，可能影响一个家庭成员（单例病例）或至少两个家庭成员（家庭案件）。这些双亲摩尔主要是由NLRP7或KHDC3L在患者9，10，11，12的隐性突变引起的。在NLRP7中隐性突变的患者中双亲HM可以通过形态分析诊断为CHM或PHM，这似乎与患者13、14突变的严重程度有关。除了根据基因型对HM进行分类外，采用和使用几种基因分型方法，使各种摩尔实体与非摩尔流产（如非倍体双亲概念和其他类型的概念5，15。这种概念可能有一些营养性增殖和异常的绒布形态，在一定程度上模仿HM的一些形态特征。
本文的目的是为形式固定石蜡嵌入（FFPE）组织的多路基因分型和流式细胞学提供详细的方案，并全面分析这些方法的结果及其与其他方法的集成。对摩尔组织的正确和结论性诊断。
Protocol
Representative Results
Discussion
HM是具有异质病因的异常人类妊娠，具有不同的组织学和基因类型，这使得其准确的分类和诊断具有挑战性。组织形态学评估往往被证明是不准确的，因此本身是不可靠的，将HM分类为CHM和PHM，并将其与非摩尔流产区分开来。因此，对HM的准确诊断需要使用其他方法，如多路微卫星DNA基因分型、流式细胞测定策略分析、FISH的多向分析以及p57KIP2免疫血症分析。这些方法各有其局限性和优势。…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢索菲·帕特里亚尔和玛丽安·帕雷西分享了原始的流式细胞测定方案，以及Promega和Qiagen提供用品和试剂。这项工作得到了生殖研究和加拿大卫生研究所（MOP-130364）到R.S.的支持。
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
Riferimenti
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
