माइक्रोसैटेलाइट डीएनए जेनोटाइपिंग और फ्लो साइटोमेट्री प्लॉयडी फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड हाइडाटिफॉर्म मोलर टिज़केस का विश्लेषण करता है।
Summary
Hydatidiform moles विषमांगी एटिओलोलोजी के साथ असामान्य मानव गर्भधारण कर रहे हैं कि उनके आकृतिक सुविधाओं और मोलर जीनोम के लिए माता पिता का योगदान के अनुसार वर्गीकृत किया जा सकता है. यहाँ, मल्टीप्लेक्स माइक्रोसेटेलाइट डीएनए जीनोटाइपिंग और प्रवाह साइटोमेट्री के प्रोटोकॉल को फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड मोलर ऊतकों के विस्तार से वर्णित किया गया है, परिणामों की व्याख्या और एकीकरण के साथ।
Abstract
Hydatidiform तिल (एचएम) एक असामान्य मानव गर्भावस्था अत्यधिक trophoblastic प्रसार और असामान्य भ्रूण विकास की विशेषता है. सूक्ष्म रूपात्मक मूल्यांकन, पूर्ण एचएम (सीएचएम) और आंशिक एचएम (पीएचएम) के आधार पर एचएम के दो प्रकार हैं। इन्हें मोलर जीनोम में माता-पिता के योगदान के आधार पर और विभाजित किया जा सकता है। एचएम की ऐसी विशेषता, आकृति विज्ञान और जीनोटाइप विश्लेषण द्वारा, रोगी प्रबंधन के लिए और इस पेचीदा विकृति की मौलिक समझ के लिए महत्वपूर्ण है। यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि एचएम के रूपात्मक विश्लेषण व्यापक interobserver परिवर्तनशीलता के अधीन है और अपने दम पर पर्याप्त नहीं है सही CHM और PHM में एचएम वर्गीकृत और उन्हें hydropic गैर-मोलर गर्भपात से अलग. जेनोटाइपिंग विश्लेषण ज्यादातर डीएनए और ऊतकों पर औपचारिक रूप से तय पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) गर्भाधान के उत्पादों से किया जाता है, जो इष्टतम गुणवत्ता से कम है और इसके परिणामस्वरूप गलत निष्कर्ष ले जा सकता है। इस आलेख में, FFPE मोलर ऊतकों के मल्टीप्लेक्स जीनोटाइपिंग और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं, इन विधियों के परिणामों की व्याख्या के साथ, उनकी समस्या निवारण, और आकृतिक मूल्यांकन के साथ एकीकरण , p57KIP2 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, और एक सही और मजबूत निदान तक पहुँचने के लिए situ संकरीकरण (फिश) में फ्लोरोसेंट। यहाँ, लेखकों तरीकों और गर्भाधान के लगभग 400 उत्पादों के विश्लेषण से पिछले 10 वर्षों में सीखा सबक का हिस्सा है.
Introduction
एक hydatidiform तिल (एचएम) एक असामान्य मानव गर्भावस्था असामान्य भ्रूण विकास, ट्रोपोब्लास्ट के अतिप्रसार, और chorionic villi (सीवी) के हाइड्रोपिक अध: पतन की विशेषता है। ऐतिहासिक रूप से, एचएम को दो प्रकारों में विभाजित किया जाता था, पूर्ण एचएम (सीएचएम) और आंशिक एचएम (पीएचएम) केवल आकृतिक मूल्यांकन1पर आधारित होता था। तथापि, यह दर्शाया गया है कि केवल रूपात्मक मूल्यांकन एचएम को दो उपप्रकारों (सीएचएम और पीएचएम) में वर्गीकृत करने और उन्हें गैर-मोलर गर्भपात2,3,4से अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं है।
क्योंकि CHM और PHM द्रोह करने के लिए विभिन्न propensities है, इसलिए यह सही रोगियों के लिए उचित अनुवर्ती और प्रबंधन प्रदान करने के लिए एचएम के जीनोटिपिक प्रकार का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। नतीजतन, पिछले दशकों में, कई तरीकों को विकसित किया गया है और मोलर ऊतकों के लिए माता पिता के योगदान की पहचान करने और एचएम का एक सही वर्गीकरण तक पहुँचने के उद्देश्य के लिए विकसित किया गया है। इनमें केरियोटाइप विश्लेषण, गुणसूत्र बैंडिंग बहुरूपता, मानव ल्यूकोसाइट प्रतिजन (एचएलए) सीरियोलॉजिकल टाइपिंग, प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता, अग्रानुक्रम दोहराता की चर संख्या, माइक्रोसैटेलाइट जीनोटाइपिंग, प्रवाह साइटोमेट्री, और p57 शामिल हैं। KIP2 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री. यह उनके जीनोम के लिए माता पिता के योगदान के आधार पर एचएम अवधारणाओं का सटीक उपविभाजन की अनुमति दी है, इस प्रकार है: CHM, जो द्विगुणित और पादपिक मोनोस्पर्मिक या द्विगुणित और पादपजनिक अपरूपण कर रहे हैं, और PHM, जो त्रिगुणित हैं, 99% में dispermic और 1% मामलों में मोनोस्पर्मी5,6,7,8. इसके अलावा, वहाँ एचएम का एक और जीनोटिपिक प्रकार है कि पिछले दो दशकों में उभरा है, जो द्विगुणित द्विगुणित है. उत्तरार्द्ध ज्यादातर आवर्तक है और एक ही परिवार के सदस्य (सरल मामलों) या कम से कम दो परिवार के सदस्यों (परिवार के मामलों) को प्रभावित कर सकते हैं. ये द्विगुणित द्वि-पैरेले मोल्स अधिकतर रोगियों में एनएलआरपी7 या केएचडीसी3एल में अप्रभावी उत्परिवर्तनों के कारण होते हैं9,10,11,12. NLRP7 में अप्रभावी उत्परिवर्तन ों वाले रोगियों में द्विगुणित द्वि-माता- एचएम को रूपात्मक विश्लेषण द्वारा सीएचएम या पी एच एम के रूप में निदान किया जा सकता है और ऐसा रोगियों में उत्परिवर्तनों की गंभीरता से जुड़ा हुआ प्रतीत होता है13,14. एचएम के वर्गीकरण के अलावा उनके जीनोटाइप के अनुसार, कई जीनोटाइपिंग विधियों के परिचय और उपयोग ने विभिन्न मोलर संस्थाओं के भेद को गैर-मोलर गर्भपातों से भेद की अनुमति दी, जैसे कि एनुलॉयड द्विगुणित द्विगुणित संकल्पनाऔर अन्य प्रकार की धारणाएं5,15. इस तरह की धारणाओं में कुछ ट्रोफोब्लास्ट प्रसार और असामान्य ग्रामीण आकृति विज्ञान हो सकता है जो कुछ हद तक एचएम की कुछ आकृतिक विशेषताओं की नकल करते हैं।
इस लेख का उद्देश्य multix जीनोटाइपिंग और औपचारिक रूप से तय पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) ऊतकों के प्रवाह साइटोमेट्री के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करना है, और इन विधियों के परिणामों और अन्य तरीकों के साथ उनके एकीकरण के व्यापक विश्लेषण के लिए मोलर ऊतकों का सही और निर्णायक निदान।
Protocol
Representative Results
Discussion
एचएम विषमांगी etiologies के साथ असामान्य मानव गर्भधारण कर रहे हैं और उनके सटीक वर्गीकरण और निदान चुनौतीपूर्ण बनाता है जो विभिन्न हिस्टोलॉजिकल और जीनोटिपिक प्रकार है। हिस्टोपैथोलॉजिकल रूपात्मक मूल्यांकन …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों की आपूर्ति और अभिकर्मकों प्रदान करने के लिए मूल प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल साझा करने के लिए सोफी Patrier और Marianne Parsy धन्यवाद. इस काम के लिए आरसेउ कुब-कोइस एन प्रजनन और कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (एमओपी-130364) द्वारा आर.एस.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
Riferimenti
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