ホルマリン固定パラフィン埋め込みヒダチジフォームモル組織のマイクロサテライトDNAジェノタイピングとフローサイトメトリープロイディ解析
Summary
ヒダチジフォームほくろは、形態学的特徴およびモルゲノムへの親の寄与に応じて分類することができる異種性腸科を有する異常なヒト妊娠である。ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込みモル組織の多重マイクロサテライトDNAジェノタイピングおよびフローサイトメトリーのプロトコルを、結果の解釈および統合とともに詳細に説明する。
Abstract
ヒダチジフォームほくろ(HM)は、過剰な栄養芽細胞増殖および異常な胚発生を特徴とする異常なヒト妊娠である。顕微鏡形態学的評価に基づくHMには、完全HM(CHM)と部分HM(PHM)の2種類があります。これらは、モルゲノムに対する親の寄与に基づいてさらに細分化することができる。HMのこのような特性化は、形態学および遺伝子型分析によって、患者管理およびこの興味深い病理の基本的な理解のために重要である。HMの形態学的解析は広い観察者間変動の影響を受け、HMをCHMおよびPHMに正確に分類し、水中非モル中絶と区別するには十分ではないことが十分に文書化されている。ジェノタイピング分析は、主に、最適な品質を持たないホルムリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)製品のDNAおよび組織に対して行われ、結果的に間違った結論につながる可能性があります。本稿では、FFPEモル組織の多重ゲノタイピングおよびフローサイトメトリー分析のための詳細なプロトコルを提供し、これらの方法の結果の解釈、トラブルシューティング、および形態学的評価との統合を提供する。、p57KIP2免疫組織化学、およびその中の蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)は、正しく、堅牢な診断に達する。ここでは、約400の概念製品の分析から過去10年間に学んだ方法と教訓を共有する。
Introduction
ヒダチジフォームほくろ(HM)は、異常な胚発生、栄養芽細胞の過剰増殖、絨毛絨毛性絨毛(CV)の水文変性を特徴とする異常なヒト妊娠である。従来、HMは形態学的評価1のみに基づいて完全なHM(CHM)と部分HM(PHM)の2種類に分けられており、従来は2種類に分けられております。しかし、形態学的評価だけではHMを2つのサブタイプ(CHMおよびPHM)に分類し、非モル流産2、3、4と区別するには不十分であることが示されている。
CHMとPHMは悪性腫瘍に対する傾向が異なるため、患者に適切なフォローアップと管理を提供するために、HMのゲノムタイプを正確に決定することが重要です。その結果、過去数十年にわたり、モル組織に対する親の寄与を特定し、HMの正しい分類に達することを目的として、いくつかの方法論が開発され、進化してきました。これらには、核型分析、染色体バンディング多型、ヒト白血病抗原(HLA)血清、制限断片長多型、可変数のカンデム反復、マイクロサテライトジェノタイピング、フローサイトメトリー、およびp57が含まれます。KIP2免疫組織化学。これにより、ゲノムに対する親の貢献に基づくHM概念の正確な細分化が可能になりました:CHMは、ジプロイド・アンドロティック・モノスマティックまたはディプロイド・アンドロゲンティック・ディスパーミックであり、PHMは99%で、99%のディスパーミックであり、症例5、6、7、8の1%で単精子。さらに、過去20年間に出現した別のゲノムタイプのHMがあり、これは二重親である。後者は主に再発し、単一の家族(シンプレックス症例)または少なくとも2つの家族(家族の場合)に影響を与える可能性があります。これらの二重親モルは、主に患者9、10、11、12におけるNLRP7またはKHDC3Lの劣性変異によって引き起こされる。NLRP7における劣性変異を有する患者における二葉性双親HMは、形態学的分析によってCHMまたはPHMと診断され、これは患者13、14における変異の重症度と関連していると思われる。彼らの遺伝子型に従ったHMの分類に加えて、いくつかの遺伝子タイピング法の導入と使用は、異球体二親の概念のような非モル流産からの様々なモルエンティティの区別を可能にしました。概念の他のタイプ5,15.このような概念は、ある程度、HMのいくつかの形態学的特徴を模倣するいくつかの栄養芽細胞増殖および異常な絨毛形態を持ち込む可能性がある。
この記事の目的は、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織の多重ゲノタイピングとフローサイトメトリーの詳細なプロトコルを提供し、これらの方法の結果と他の方法との統合の包括的な分析を提供することです。モル組織の正しく、決定的な診断。
Protocol
Representative Results
Discussion
HMは異種病因を有する異常なヒト妊娠であり、異なる組織学的および好奇数型を有し、正確な分類および診断を困難にする。ヒト病理学的形態学的評価はしばしば不正確であることが証明され、したがって、HMをCHMおよびPHMに分類し、非臼頭流産と区別するために単独で信頼性が低い。したがって、HMの正確な診断には、多重マイクロサテライトDNAジェノタイピング、フローサイトメトリーに?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、元のフローサイトメトリープロトコルを共有してくれたソフィー・パトリアーとマリアンヌ・パレシー、および供給と試薬を提供するためのプロメガとキアゲンに感謝しています。この研究は、レソー・ケベコイス・アン・リオー殖とカナダ保健研究所(MOP-130364)によってR.S.に支援されました。
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
Riferimenti
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