마이크로위성 DNA 게노티핑 및 유동 세포분석분석분석포르민고정파라핀내장화증모금조직
Summary
수다디형 두더지(Hydatidiform moles)는 어금니 게놈에 대한 부모의 기여와 형태학적 특징에 따라 분류될 수 있는 이기종 빈치학을 가진 비정상적인 인간 임신입니다. 여기서, 멀티플렉스 마이크로위성 DNA 의전성 및 포르말린 파라핀 내장 어금니 조직의 유동 세포분석프로토콜은 결과의 해석 및 통합과 함께 상세히 기술된다.
Abstract
수다디폼 두더지(HM)는 과도한 트로포블라아제 증식과 비정상적인 배아 발달을 특징으로 하는 비정상적인 인간 임신입니다. 현미경 형태 학적 평가, 완전한 HM (CHM) 및 부분 HM (PHM)에 따라 HM의 두 가지 유형이 있습니다. 이들은 어금니 게놈에 대한 부모의 기여에 기초하여 더 세분화될 수 있습니다. 형태학 및 유전자형 분석에 의한 HM의 이러한 특성화는 환자 관리및 이 흥미로운 병리학의 근본적인 이해에 매우 중요합니다. HM의 형태학적 분석은 광범위한 관찰자 간 가변성의 영향을 받으며 HM을 CHM 및 PHM으로 정확하게 분류하고 수경 비 어금니 낙태와 구별하기에 충분하지 않다는 것이 잘 문서화되어 있습니다. Genotyping 분석은 주로 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 개념작용의 제품에서 DNA 와 조직에 수행되며, 이는 최적의 품질보다 적고 결과적으로 잘못된 결론으로 이어질 수 있습니다. 이 문서에서는, FFPE 어금니 조직의 다중 지질 분석 및 유동 세포 분석 분석을 위한 상세한 프로토콜은, 이 방법의 결과의 해석과 더불어, 그들의 문제 해결 및 형태학적 평가와의 통합과 더불어 제공됩니다 , p57KIP2 면역성 화학 및 현장 혼성화 (FISH)에서형광은 정확하고 견고한 진단에 도달합니다. 여기에서 저자는 약 400개의 개념 작용 제품을 분석하여 지난 10년 동안 배운 방법과 교훈을 공유합니다.
Introduction
수다디폼 두더지(HM)는 비정상적인 배아 발달, 트로포블라스트의 과증식, 융모융물(CV)의 수경 변성을 특징으로 하는 비정상적인 인간 임신입니다. 역사적으로, HM은 형태학적 평가1에기초하여 완전한 HM(CHM) 및 부분 HM(PHM)의 두 가지 유형으로 나뉘었다. 그러나, 형태학적 평가만으로는 HM을 두 개의 아류형(CHM 및 PHM)으로 분류하고 이를 비어치 유산2,3,4와구별하기에 충분하지 않은 것으로 나타났다.
CHM과 PHM은 악성 종양에 다른 성향을 가지고 있기 때문에, 환자에게 적절한 후속 및 관리를 제공하기 위해 HM의 유전자 형 유형을 정확하게 결정하는 것이 중요합니다. 따라서 지난 수십 년 동안 어금니 조직에 대한 부모의 기여를 확인하고 HM의 올바른 분류에 도달하기 위해 여러 가지 방법론이 개발되고 발전했습니다. 여기에는 핵형 분석, 염색체 밴딩 다형성, 인간 백혈구 항원 (HLA) 혈청학적 입력, 제한 단편 길이 다형성, 가변 수의 탠덤 반복, 마이크로 위성 유전자 변형, 유세포 분석 및 p57이 포함됩니다. KIP2 면역 화학. 이것은 그들의 게놈에 부모 기여에 근거를 둔 HM 개념의 정확한 세분화를 허용했습니다, 다음과 같이: CHM, 이는 이월 및 유전적 단정자 또는 디플로이드 안드로이노믹 분산증, 및 PHM, 이는 삼엽충, 99%에서 분산성 및 케이스5,6,7,8의1 %에서 단정자 . 게다가, 지난 2 년간 에서 나타난 HM의 또 다른 genotypic 모형이 있습니다, 이는 이형 양부모입니다. 후자는 주로 재발하고 단일 가족 구성원 (심플렉스 케이스) 또는 적어도 2 개의 가족 구성원 (가족 케이스)에 영향을 미칠 수 있습니다. 이들 디플로이드 두더지들은 주로 환자9,10,11,12에서 NLRP7 또는 KHDC3L의 열성 돌연변이에 의해 유발된다. NLRP7에서 열성 돌연변이를 가진 환자에서 디플로이드 양부모 HM은 형태학적 분석에 의해 CHM 또는 PHM으로 진단될 수 있으며 이는 환자13,14에서돌연변이의 중증도와 연관된 것으로 보인다. 그들의 유전자형에 따른 HM의 분류 이외에, 몇몇 유전형질 방법의 소개 그리고 사용은 이누엽 이완 양부모 개념과 같은 비 어금니 유산에서 각종 대구물 엔티티의 구별을 허용하고 개념의 다른 유형5,15. 이러한 개념은 HM의 일부 형태학적 특징을 어느 정도 모방하는 trophoblast 증식 및 비정상적인 융모 형태를 가질 수 있습니다.
이 문서의 목적은 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직의 다중 지질 분석 및 유세포 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고, 이러한 방법의 결과와 다른 방법과의 통합에 대한 포괄적 인 분석을 제공하는 것입니다. 어금니 조직의 정확하고 결정적인 진단.
Protocol
Representative Results
Discussion
HM은 이질적인 병인을 가진 이상한 인간 적인 임신이고 그들의 정확한 분류 및 진단을 도전하게 하는 다른 조직학 및 genotypic 모형이 있습니다. 조직 병리학 적 형태 학적 평가는 종종 부정확입증되었고 따라서 HM을 CHM 및 PHM으로 분류하고 비 어금니 유산과 구별하기 위해 자체적으로 신뢰할 수 없습니다. 따라서 HM의 정확한 진단은 멀티플렉스 마이크로위성 DNA 지질분석, 유세포분석에 의한 계략 분…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원래 의 흐름 세포 분석 프로토콜을 공유 소피 패트리어와 마리안 파레시 감사, 공급 및 시약을 제공하는 프로메가와 Qiagen. 이 작품은 레소 Québécois en 생식및 건강 연구를 위한 캐나다 연구소 (MOP-130364)에 의해 R.S에 지원되었습니다.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
Riferimenti
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