Mikrosatellittmarkør DNA genotyperingteknologi og Flow flowcytometri Ploidy analyser av formalin-fast parafin-embedded Blæremola molar vev
Summary
Blæremola føflekker er unormale menneskelige svangerskap med heterogene etiologi som kan klassifiseres i henhold til deres morfologiske funksjoner og foreldrenes bidrag til molar genomer. Her er protokoller av multiplex mikrosatellittmarkør DNA genotyperingteknologi og flyt flowcytometri av formalin-fast parafin-embedded molar vev beskrevet i detalj, sammen med resultatene ‘ tolkning og integrering.
Abstract
Blæremola Mole (HM) er en unormal menneskelig graviditet preget av overdreven trofoblastiske spredning og unormal embryoutvikling. Det er to typer HM basert på en mikroskopisk morfologiske evaluering, komplett HM (CHM) og delvis HM (PHM). Disse kan videre deles basert på foreldrenes bidrag til molar genomer. Slik karakterisering av HM, ved morfologi og genotype analyser, er avgjørende for pasientbehandling og for den grunnleggende forståelsen av denne spennende patologi. Det er godt dokumentert at morfologiske analyse av HM er underlagt bred interobserver variasjon og er ikke tilstrekkelig på egen hånd for å nøyaktig klassifisere HM i CHM og PHM og skille dem fra hydropic ikke-molar aborter. Genotyperingteknologi analyse er hovedsakelig utført på DNA og vev fra formalin-fast parafin-embedded (FFPE) produkter av unnfangelsen, som har mindre enn optimal kvalitet og kan følgelig føre til feil konklusjoner. I denne artikkelen, detaljerte protokoller for multiplex genotyperingteknologi og flyt flowcytometri analyser av FFPE molar vev er gitt, sammen med tolkningen av resultatene av disse metodene, deres feilsøking, og integrasjon med morfologiske evaluering , P57KIP2 immunhistokjemi og fluorescens in situ HYBRIDISERING (Fish) for å nå en korrekt og robust diagnose. Her forfatterne dele metoder og erfaringer i de siste 10 årene fra analysen av ca 400 produkter av unnfangelsen.
Introduction
En blæremola muldvarp (HM) er en unormal menneskelig graviditet preget av unormal embryoutvikling, hyperproliferation av trophoblast, og hydropic degenerasjon av humant Villi (CV). Historisk sett brukte HM å deles inn i to typer, komplett HM (CHM) og delvis HM (PHM) basert bare på morfologiske evaluering1. Det har imidlertid vist seg at morfologiske evaluering alene ikke er tilstrekkelig til å klassifisere hm i de to under typer (chm og PHM) og skille dem fra ikke-molar aborter2,3,4.
Fordi CHM og PHM har forskjellige propensities til ondartet, er det derfor viktig å nøyaktig bestemme den genotypisk typen HM for å gi riktig oppfølging og behandling til pasientene. Følgelig, i de siste ti årene, flere metoder har blitt utviklet og utviklet for det formål å identifisere foreldrenes bidrag til molar vev og nå en riktig klassifisering av HM. Disse inkluderer Karyotype analyse, kromosom striper polymorfisme, Human leukocytter antigen (HLA) serologisk skrive, begrensning fragment lengde polymorfisme, variabel antall tandem gjentar, mikrosatellittmarkør genotyperingteknologi, flyt flowcytometri, og P57 KIP2 immunhistokjemi. Dette har tillatt nøyaktig oppdeling av HM konsepsjoner basert på foreldrenes bidrag til deres genomer, som følger: CHM, som er diploid androgenetic monospermic eller diploid androgenetic dispermic, og PHM, som er triploid, dispermic i 99% og monospermic i 1% av tilfellene5,6,7,8. Videre er det en annen genotypisk type HM som oppsto i de siste to ti årene, som er diploid biparental. Sistnevnte er mest tilbakevendende og kan påvirke et enkelt familiemedlem (simplex tilfeller) eller minst to familiemedlemmer (familiær saker). Disse diploid biparental føflekker er hovedsakelig forårsaket av resessivt mutasjoner i NLRP7 eller KHDC3L i pasienter9,10,11,12. Diploid biparental hm hos pasienter med resessivt mutasjoner i NLRP7 kan diagnostiseres som chm eller PHM av morfologiske analyse og dette synes å være assosiert med alvorlighetsgraden av mutasjoner i pasientene13,14. I tillegg til klassifisering av HM i henhold til deres genotyper, innføring og bruk av flere genotyperingteknologi metoder tillot skillet mellom de ulike molar enheter fra ikke-molar aborter, slik som aneuploid diploid biparental konsepsjoner og andre typer konsepsjoner5,15. Slike forestillinger kan ha noen trophoblast spredning og unormal villous morfologi som etterligner, til en viss grad, noen morfologiske funksjoner av HM.
Hensikten med denne artikkelen er å gi detaljerte protokoller for multiplex genotyperingteknologi og flyt flowcytometri av formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vev, og omfattende analyser av resultatene av disse metodene og deres integrasjon med andre metoder for korrekt og avgjørende diagnose av molar vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
HM er unormal menneskelige svangerskap med heterogene årsaker og har ulike histologiske og genotypisk typer, som gjør deres nøyaktige klassifisering og diagnose utfordrende. Histopathological morfologiske evalueringen ble ofte påvist unøyaktig og er derfor upålitelig på egen hånd for å klassifisere HM i CHM og PHM og skille dem fra ikke-molar aborter. Derfor krever en nøyaktig diagnose av HM bruk av andre metoder som multiplex mikrosatellittmarkør DNA-genotyperingteknologi, ploidy analyse ved flyt flowcytometr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Sophie Patrier og Marianne Parésy for å dele den opprinnelige flyten flowcytometri protokollen, og Promega og Qiagen for å gi forsyninger og reagenser. Dette arbeidet ble støttet av Réseau Québécois no reproduksjon og Canadian Institute for Health Research (MOP-130364) til R.S.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
Riferimenti
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
