Genotipado de ADN microsatélite y análisis de ploidía de citometría de flujo de tejidos molares de parafina incorporados en parafina-involuntaria-incrustadas
Summary
Los lunares hidatidiformes son embarazos humanos anormales con etiologías heterogéneas que se pueden clasificar según sus características morfológicas y la contribución parental a los genomas molares. Aquí, los protocolos de genotipado de ADN microsatélite multiplex y citometría de flujo de tejidos molares de parafina incrustados fijados por formalina se describen en detalle, junto con la interpretación e integración de los resultados.
Abstract
El lunar hidatidiformo (HM) es un embarazo humano anormal caracterizado por una proliferación trofoblástica excesiva y un desarrollo embrionario anormal. Existen dos tipos de HM basados en la evaluación morfológica microscópica, HM completa (CHM) y HM parcial (PHM). Estos pueden subdividirse aún más en función de la contribución parental a los genomas molares. Tal caracterización de HM, por morfología y análisis de genotipos, es crucial para el manejo del paciente y para la comprensión fundamental de esta patología intrigante. Está bien documentado que el análisis morfológico de HM está sujeto a una amplia variabilidad interobservador y no es suficiente por sí solo para clasificar con precisión hm en CHM y PHM y distinguirlos de abortos hidropicos no molares. El análisis de genotipado se realiza principalmente en EL ADN y los tejidos de los productos de concepción de parafina fijados en formalina (FFPE), que tienen una calidad inferior a la óptima y, por lo tanto, pueden conducir a conclusiones erróneas. En este artículo, se proporcionan protocolos detallados para el genotipado multiplex y análisis de citometría de flujo de los tejidos molares FFPE, junto con la interpretación de los resultados de estos métodos, su solución de problemas y la integración con la evaluación morfológica , inmunohistoquímica p57KIP2 e hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para llegar a un diagnóstico correcto y robusto. Aquí, los autores comparten los métodos y lecciones aprendidas en los últimos 10 años del análisis de aproximadamente 400 productos de concepción.
Introduction
Un lunar hidatidiformo (HM) es un embarazo humano anormal caracterizado por un desarrollo embrionario anormal, hiperproliferación del trofototo y degeneración hidrográfica de vellosidades coriónicas (CV). Históricamente, HM solía dividirse en dos tipos, HM completo (CHM) y HM parcial (PHM) basado únicamente en la evaluación morfológica1. Sin embargo, se ha demostrado que la evaluación morfológica por sí sola no es suficiente para clasificar HM en los dos subtipos (CHM y PHM) y distinguirlos de los abortos espontáneos no molares2,3,4.
Debido a que CHM y PHM tienen diferentes propensiones a las neoplasias malignas, por lo tanto, es importante determinar con precisión el tipo genotípico de HM para proporcionar un seguimiento y un manejo adecuados a los pacientes. En consecuencia, en las últimas décadas, se han desarrollado y evolucionado varias metodologías con el fin de identificar la contribución parental a los tejidos molares y alcanzar una clasificación correcta de HM. Estos incluyen análisis de cariotipo, polimorfismo de bandas cromosómicas, tilometría serológica de antígeno leucocito humano (HLA), polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, número variable de repeticiones en tándem, genotipado de microsatélites, citometría de flujo y p57 Inmunohistoquímica KIP2. Esto ha permitido una subdivisión precisa de las concepciones hm basadas en la contribución de los padres a sus genomas, de la siguiente manera: CHM, que son diploides androgenéticos androgenéticos o diploides dispermicos androgenéticos, y PHM, que son triploide, disperménico en 99% y monobrímico en el 1% de los casos5,6,7,8. Además, hay otro tipo de HM genotípico que surgió en las últimas dos décadas, que es diploide biparental. Este último es en su mayoría recurrente y puede afectar a un solo miembro de la familia (casos simplex) o al menos a dos miembros de la familia (casos familiares). Estos lunares biparentales diploides son causados principalmente por mutaciones recesivas en NLRP7 o KHDC3L en los pacientes9,10,11,12. Diploid biparental HM en pacientes con mutaciones recesivas en NLRP7 puede ser diagnosticado como CHM o PHM por análisis morfológico y esto parece estar asociado con la gravedad de las mutaciones en los pacientes13,14. Además de la clasificación de HM según sus genotipos, la introducción y el uso de varios métodos de genotipado permitieron distinguir las diversas entidades molares de los abortos espontáneos no molares, tales como concepciones biparentales diploides aneuploides y otros tipos de concepciones5,15. Tales concepciones pueden tener alguna proliferación de trofoblastos y morfología villosa anormal que imitan, hasta cierto punto, algunas características morfológicas de HM.
El propósito de este artículo es proporcionar protocolos detallados para el genotipado multiplex y la citometría de flujo de los tejidos de parafina incrustada en formalina-fijación (FFPE), y análisis exhaustivos de los resultados de estos métodos y su integración con otros métodos para diagnóstico correcto y concluyente de los tejidos molares.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los HM son embarazos humanos anormales con etiologías heterogéneas y tienen diferentes tipos histológicos y genotípicos, lo que hace que su clasificación y diagnóstico precisos sean desafiantes. La evaluación morfológica histopatológica a menudo se demostró inexacta y, por lo tanto, no es fiable por sí sola para clasificar a HM en CHM y PHM y distinguirlos de los abortos espontáneos no molares. Por lo tanto, un diagnóstico preciso de HM requiere el uso de otros métodos como el genotipado de ADN multix micro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Sophie Patrier y Marianne Parésy por compartir el protocolo original de citometría de flujo, y Promega y Qiagen por proporcionar suministros y reactivos. Este trabajo fue apoyado por el Réseau Québécois en Reproduction y el Instituto Canadiense de Investigación Sanitaria (MOP-130364) a R.S.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
Riferimenti
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