Formalin-sabit Parafin gömülü Hydatidiform Molar Dokuların Mikrouydu DNA Genotipleme ve Akış Sitometri Ploidy Analizleri
Summary
Hydatidiform benler, morfolojik özelliklerine ve molar genomlara ebeveyn katkısına göre sınıflandırılabilen heterojen etiyolojileri olan anormal insan gebelikleridir. Burada formalin-sabit parafin gömülü azı laksamalarının multipleks mikrouydu DNA genotipleme ve akış sitometrisi protokolleri, sonuçların yorumlanması ve entegrasyonu ile birlikte ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Hidatidiform mol (HM), aşırı trofoblastik proliferasyon ve anormal embriyonik gelişim ile karakterize anormal bir insan gebeliğidir. Mikroskobik morfolojik değerlendirmeye dayalı iki tip HM vardır: komple HM (CHM) ve kısmi HM (PHM). Bunlar, molar genomlarına ebeveyn katkısına göre daha fazla alt bölümlere ayrılabilir. HM’nin morfoloji ve genotip analizleri ile böyle bir karakterizasyonu, hasta yönetimi ve bu ilginç patolojinin temel anlayışı için çok önemlidir. HM’nin morfolojik analizinin geniş bir gözlemci ler arası değişkenliğe tabi olduğu ve HM’yi CHM ve PHM’ye doğru bir şekilde sınıflandırmak ve bunları hidropik molar olmayan düşüklerden ayırmak için tek başına yeterli olmadığı belgelenmiştir. Genotipleme analizi çoğunlukla optimal kaliteden daha az olan ve sonuç olarak yanlış sonuçlara yol açabilecek formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) döllenme ürünlerinden DNA ve dokular üzerinde yapılır. Bu makalede FFPE molar dokularının çokk genotipleme ve akış sitometri analizleri için ayrıntılı protokoller, bu yöntemlerin sonuçlarının yorumlanması, bunların sorun giderme ve morfolojik değerlendirme ile entegrasyon ile birlikte sağlanmaktadır. , p57KIP2 immünohistokimya, ve floresan yerinde hibridizasyon (FISH) doğru ve sağlam bir tanı ulaşmak için. Burada yazarlar, son 10 yılda yaklaşık 400 conception ürününün analizinden öğrenilen yöntem ve dersleri paylaşıyorlar.
Introduction
Hydatidiform mol (HM), anormal embriyonik gelişim, trofoblastın hiperproproproproproproprobu ve koryonik villinin hidropik dejenerasyonu (CV) ile karakterize anormal bir insan gebeliğidir. Tarihsel olarak, HM iki tip, tam HM (CHM) ve kısmi HM (PHM) sadece morfolojik değerlendirme1dayalı bölünmüş olması için kullanılır. Ancak, morfolojik değerlendirmenin tek başına HM’yi iki alt tipe (CHM ve PHM) ayırmak ve bunları molar olmayan düşüklerden ayırmak için yeterli olmadığı gösterilmiştir2,3,4.
CHM ve PHM’nin malignitelere göre farklı eğilimleri olduğundan, hastalara uygun takip ve yönetimi sağlamak için genotik HM tipini doğru bir şekilde belirlemek önemlidir. Sonuç olarak, son yıllarda, azı laklarına ebeveyn katkısını belirlemek ve HM’nin doğru bir sınıflandırmasına ulaşmak amacıyla çeşitli metodolojiler geliştirilmiş ve geliştirilmiştir. Bunlar arasında karyotip analizi, kromozom bantlama polimorfizmi, insan lökosit antijeni (HLA) serolojik yazma, restriksiyon parça uzunluğu polimorfizmi, değişken tandem tekrarı sayısı, mikrouydu genotipleme, akış sitometrisi ve p57 KIP2 immünohistokimya. Bu, hm gebelerinin genomlarına ebeveyn katkısına dayalı doğru bir alt bölüme sahip olmasına olanak sağlamıştır: Dploid androgenetik monospermik veya diploid androgenetik dispermik olan CHM ve triploid olan PHM, %99 ve olguların %1’inde monospermik5,6,7,8. Ayrıca, son yirmi yılda ortaya çıkan başka bir genotypic HM tipi vardır, hangi diploid biparental olduğunu. İkincisi çoğunlukla tekrarlayan ve tek bir aile üyesi etkileyebilir (simpleks durumlarda) veya en az iki aile üyesi (ailesel durumlarda). Bu diploid biebeveyn benler çoğunlukla NLRP7 veya KHDC3L hastalarda9,10,11,12resesif mutasyonlar neden olur. NLRP7’de resesif mutasyonu olan hastalarda diploid biebeveynLI HM morfolojik analiz ile CHM veya PHM tanısı konabilir ve bu hastalardamutasyonların şiddeti ile ilişkili gibi görüner13,14. HM’nin genotiplerine göre sınıflandırılmasına ek olarak, çeşitli genotipleme yöntemlerinin tanıtımı ve kullanımı, çeşitli molar varlıkların molar olmayan düşüklerden, örneğin aneuploid diploid biebeveyn kavramları ndan ayırt edilebilmiştir ve diğer kavram türleri5,15. Bu tür kavramlar bazı trofoblast proliferasyonu ve bir dereceye kadar HM bazı morfolojik özellikleri taklit anormal villous morfolojisi olabilir.
Bu makalenin amacı, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) dokuların çokkatlı genotipleme ve akış sitometrisi için ayrıntılı protokoller sağlamak ve bu yöntemlerin sonuçlarının kapsamlı analizleri ve bunların diğer yöntemlerle bütünleştirilmesi azı laklarının doğru ve kesin tanısı.
Protocol
Representative Results
Discussion
HM heterojen etiyolojileri ile anormal insan gebelikleri ve farklı histolojik ve genotik türleri vardır, hangi onların doğru sınıflandırma ve tanı zor hale getirir. Histopatolojik morfolojik değerlendirme genellikle yanlış kanıtlanmıştır ve bu nedenle HM’yi CHM ve PHM olarak sınıflandırmak ve bunları molar olmayan düşüklerden ayırt etmek için tek başına güvenilmezdir. Bu nedenle, HM doğru bir tanı multiks mikrouydu DNA genotipleme, akış sitometri sitometri sitometri sitomi ile ploidi anali…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar sophie Patrier ve Marianne Parésy orijinal akış sitometri protokolü paylaşımı için teşekkür ve Promega ve Qiagen malzemeleri ve reaktifler sağlamak için. Bu çalışma Réseau Québécois en Reprodüksiyon ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (MOP-130364) tarafından R.S.’ye destek lenmiştir.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
Riferimenti
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
