Etablierung und Analyse von dreidimensionalen (3D) Organoiden, abgeleitet von Patienten prostatakrebs Knochenmetastasen Proben und ihre Xenografts
Summary
Dreidimensionale Kulturen von Patienten-BMPC-Proben und Xenografts von Knochenmetastasierung Prostatakrebs erhalten die funktionelle Heterogenität ihrer ursprünglichen Tumoren, was zu Zysten, Sphäroiden und komplexen, tumorartigen Organoiden führt. Dieses Manuskript bietet eine Optimierungsstrategie und ein Protokoll für die 3D-Kultur heterogener Patientenproben und deren Analyse mit IFC.
Abstract
Die dreidimensionale (3D) Kultur von Organoiden aus Tumorproben menschlicher Patienten und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX), die als patientenabgeleitete Organoide (g.U.) bezeichnet werden, sind eine unschätzbare Ressource für die Untersuchung des Tumorgenese und Metastasierung von Prostatakrebs. Ihr Hauptvorteil besteht darin, dass sie die ausgeprägte genomische und funktionelle Heterogenität des ursprünglichen Gewebes im Vergleich zu herkömmlichen Zelllinien, die dies nicht tun, beibehalten. Darüber hinaus können 3D-Kulturen von g.A. verwendet werden, um die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf einzelne Patienten vorherzusagen und sind ein Schritt in Richtung personalisierte Medizin. Trotz dieser Vorteile verwenden nur wenige Gruppen diese Methode routinemäßig, zum Teil aufgrund der umfassenden Optimierung der PDO-Kulturbedingungen, die für verschiedene Patientenproben erforderlich sein können. Wir haben zuvor gezeigt, dass unsere Prostatakrebs-Knochenmetastasierung PDX-Modell, PCSD1, die Resistenz der Knochenmetastasierung des Spenderpatienten gegen Anti-Androgen-Therapie rekapituliert hat. Wir verwendeten PCSD1 3D-Organoide, um die Mechanismen der Anti-Androgen-Resistenz weiter zu charakterisieren. Nach einem Überblick über die aktuell veröffentlichten Studien zu PDX- und PDO-Modellen beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die 3D-Kultur von pDO unter Verwendung von gewölbten oder schwimmenden Kellermembran(z.B. Matrigel) Kugeln unter optimierten Kulturbedingungen. In vivo Stichbildgebung und Zellverarbeitung für die Histologie werden ebenfalls beschrieben. Dieses Protokoll kann weiter für andere Anwendungen optimiert werden, einschließlich Western Blot, Co-Culture, etc. und kann verwendet werden, um Eigenschaften von 3D-kultivierten g.Us-Dollar in Bezug auf Arzneimittelresistenz, Tumorigenese, Metastasen und Therapeutika zu erforschen.
Introduction
Dreidimensionale kultivierte Organoide haben die Aufmerksamkeit auf ihr Potenzial gelenkt, die In-vivo-Architektur, die zelluläre Funktionalität und die genetische Signatur ihrer ursprünglichen Gewebe1,2,3,4,5zu rekapitulieren. Am wichtigsten ist, 3D-Organoide aus Patiententumorgewebe oder Patienten abgeleitet Xenograft (PDX) Modelle bieten unschätzbare Möglichkeiten, Mechanismen der zellulären Signalisierung auf Tumorigenese zu verstehen und die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung auf jede Zellpopulation6,7,8,9,10,11,12,13zu bestimmen. Drost et al.5 entwickelten ein Standardprotokoll zur Etablierung von Prostataorganoiden von Mensch und Maus, das im Bereich der Urologie weit verbreitet ist. Darüber hinaus wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um 3D-Organoide weiter zu charakterisieren und die detaillierten Mechanismen der Tumorgenese und Metastasierung4,12,14,15zu verstehen. Neben dem zuvor etablierten und weithin akzeptierten Protokoll für 3D-Organoidkulturen beschreiben wir hier ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die 3D-Kultur von pDO mit drei verschiedenen Doming-Methoden unter optimierten Kulturbedingungen.
In diesem Manuskript wurden 3D-Organoide als ex vivo Modell von Knochenmetastasierung Prostatakrebs (BMPC) etabliert. Die für diese Kulturen verwendeten Zellen stammten aus der Serie Prostate Cancer San Diego (PCSD) und wurden direkt von patienten ProstatakrebsKnochenmetastasen-Tumorgeweben (PCSD18 und PCSD22) oder von Patienten abgeleiteten Xenograft-Tumormodellen (PDX) (Proben mit den Namen PCSD1, PCSD13 und PCSD17) abgeleitet. Da spontane Knochenmetastasen von Prostatakrebszellen in gentechnisch veränderten Mausmodellen16selten sind, haben wir die direkte intrafemorale (IF) Injektion menschlicher Tumorzellen in männliche Rag2-/-‘c-/- Mäuse verwendet, um die PDX-Modelle von Knochenmetastasatasanasanzen zu etablieren17.
Sobald 3D-Organoide aus heterogenen Patiententumorzellen oder von Patienten abgeleiteten Xenografts nachgewiesen wurden, ist es wichtig, ihre Identität als Prostatatumorzellen zu bestätigen und ihre Phänotypen in den 3D-Organoidkulturen zu bestimmen. Die Immunfluoreszenzchemie (IFC) ermöglicht die Visualisierung der Proteinexpression vor Ort in jeder Zelle, was häufig auf die potenziellen Funktionen für bestimmte Zellpopulationen2,4hinweist. Im Allgemeinen sind IFC-Protokolle für eine große Anzahl von Proben, einschließlich Geweben und Zellen, einfach und vollständig optimiert. Die Zelldichte und die Anzahl der Organoide können jedoch deutlich niedriger sein als die der konventionellen Kultur. Daher erfordert das IFC-Protokoll für Organoide zusätzliche Schritte, um eine ordnungsgemäße Verarbeitung und Einbettung in Paraffin für alle Organoide in die Proben zu gewährleisten. Wir beschreiben zusätzliche Schritte für einen Agarose-Voreinbettungsprozess und Tipps, um die Position von schnittförmigen Organoiden auf der Folie zu kennzeichnen, die die Erfolgsrate von IFC auf Organoiden erhöht, insbesondere wenn die Proben von Organoiden eine geringere Zelldichte als gewünscht aufweisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D-Organoide, die aus Patientenknochenmetastasen Prostatakrebszellen gewonnen werden, sind noch relativ selten. Hier beschreiben wir Strategien und weiter optimiertes Protokoll zu erfolgreich etablierten seriellen 3D-Patienten abgeleiteten Organoiden (PDOs) von BMPC. Darüber hinaus werden Protokolle beschrieben, um die Organoide in Proben mit geringerer Zelldichte für die IFC- und IHC-Analyse zu sichern. Differentialphäpnotypen in Form von Zysten, Sphäroiden und komplexeren Organoiden deuten darauf hin, dass dieses P…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Leo and Anne Albert Charitable Foundation und der JM Foundation unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des University of California San Diego Moores Cancer Center, Dr. Jing Yang und Dr. Kay T. Yeung, dass sie uns die Verwendung ihres Mikrotom und Randall French, Department of Surgery für technisches Know-how ermöglicht haben.
Materials
| 1 mL Pipettman | Gilson | F123602 | |
| 1 mL Syringe | BD Syringe | 329654 | |
| 1.5 mL tube | Spectrum Lab Products | 941-11326-ATP083 | |
| 25G Needle | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | J61899 | |
| 70% Ethanol (EtOH) | VWR | BDH1164-4LP | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| adDMEM | Life Technologies | 12634010 | |
| Agarose | Lonza | 50000 | |
| Antibody -for Cytokeratin 5 | Biolegend | 905901 | |
| Antibody for Cytokeratin 8 | Biolegend | 904801 | |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Bioluminescence imaging system, IVIS 200 | Perkin Elmer Inc | IVIS 200 | |
| Cell Culture Plate – 24 well | Costar | 3524 | |
| Cell Culture Plate – 48 well | Costar | 3548 | |
| Cell Culture Plate – 6 well | Costar | 3516 | |
| Cell Dissociation Solution, Accumax | Innovative Cell Technologies, Inc. | AM105 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.180 | |
| Cell Strainer | Falcon (Corning) | 352350 | |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3546 | |
| DAPI | Vector Vectashield | H-1200 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073-1ML | |
| dPBS | Corning/Cellgro | 21-031-CV | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| FGF10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| Forceps | Denville Scientific | S728696 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-0420401 | |
| Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Marker | VWR | 52877-355 | |
| Matrigel (Growth Factor Reduced) | Mediatech Inc. (Corning) | 356231 | |
| Matrigel (High Concentration) | BD (Fisher Scientific) | CB354248 | |
| Microscope Imaging Software, Keyence | BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software) | ||
| Microscope, Keyence | BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019) | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi | 130-104-694 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
| Noggin | PeproTech | 120-10C | |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Parafilm | American National Can | N/A | |
| Pen-Strep | Mediatech Inc. (Corning) | 30-002-CI-1 | |
| Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips) | Fisherbrand Redi-Tip | 21-197-85 | |
| Plunger (from 3 mL syringe) | BD Syringe | 309657 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
| R-Spondin 1 | Trevigen | 3710-001-01 | |
| SB2021190 | Sigma-Aldrich | S7076-25MG | |
| Small Table Top Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002426 | |
| Water Bath | Fisher Sci | 2320 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | Abmole Bioscience | M1817 |
Riferimenti
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