Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой
Summary
Целью данного протокола является формирование ансамблей молекулярных двигателей на наноструктурах ДНК оригами и наблюдение за подвижностью ансамбля с использованием общей внутренней флюоресценцийной микроскопии.
Abstract
Цитоскелетные двигатели отвечают за широкий спектр функций в эукариотических клетках, включая митоз, грузовой транспорт, подвижность клеток и другие. Многие из этих функций требуют, чтобы двигатели работали в ансамблях. Несмотря на богатые знания о механизмах отдельных цитоскелетных двигателей, сравнительно меньше известно о механизмах и возникающих поведениямоторных ансамблей, примеры которых включают изменения в процессиальности ансамбля и скорости с изменение номера двигателя, местоположения и конфигурации. Структурная нанотехнология ДНК и специфическая техника ДНК оригами позволяют молекулярно строить четко определенные архитектуры моторных ансамблей. Под контролем можно управлять формой грузовых конструкций, а также типом, количеством и размещением двигателей на конструкции. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для производства этих ансамблей и наблюдения за ними с помощью общей внутренней флуоресценции флуоресценции микроскопии. Хотя эти методы были специально применены для цитоскелетных двигателей, методы обобщаются для других белков, которые собираются в комплексах для выполнения своих задач. В целом, метод ДНК оригами для создания четко определенных ансамблей моторных белков является мощным инструментом для вскрытия механизмов, которые приводят к возникающим мотилированного поведения.
Introduction
Динейн и кинезин являются цитоскелетные моторные белки, ответственные за множество функций в эукариотических клетках1. Преобразовывая химическую энергию гидролизов АТФ в производительную работу, эти двигатели перемещают на микротрубах для перевозки и распределения различных внутриклеточных грузов. Они также координируют свои действия в массовых внутриклеточных перестановках, связанных с митозом, где они проявляют организованные силы, способствующие распозиции и разделению хромосом. Структурные, биохимические и биофизические анализы, включая наблюдения за одной молекулой, выявили механизмы этих двигателей на индивидуальном уровне (хорошо рассмотрены в предыдущих работах2,3,4). Тем не менее, многие из задач двигателей требуют, чтобы они работали в небольших ансамблях как аналогичных, так и смешанных типов двигателей. Сравнительно меньше понимается о механизмах, которые координируют деятельность и конечную возникающие подвижность этих ансамблей5,6. Этот разрыв в знаниях отчасти объясняется трудностями в создании ансамблей с управляемыми функциями, такими как тип двигателя и номер копии. За последнее десятилетие для решения этой проблемы использовались методы молекулярной конструкции ДНК-оригами. Для микротрубочек на основе двигателей, некоторые примеры этих исследований включают в себя одной молекулы наблюдений ансамблей цитоплазматического динейна-17,8,9, интрафлагеллар dynein11, различные кинезинные двигатели12,13,и смеси как диньинов, так и кинезинов7,14,15. Здесь мы предоставляем подробную информацию об очистке и олигонуклеотидной маркировке двигателей из дрожжей7,16,17,18,19,20, складывание и очистка сегментированных ДНК оригами с tunable соответствия8, и изображения дрожжевых двигателей, движущих конструкций шасси7,18.
Построение моторных ансамблей для наблюдения одной молекулы in vitro требует трех основных усилий. Во-первых, это экспрессия, очистка и маркировка конструкций двигателя, пригодных для присоединения к ДНК оригами. Во-вторых, производство и очистка определенных структур ДНК оригами (часто называют “шасси”). И третье – спряжение двигателей к конструкции шасси с последующей наблюдением с использованием общей внутренней отражения флуоресценции (TIRF) микроскопии. Здесь мы предоставляем установленные протоколы для этого процесса для рекомбинантных микротрубоукладных двигателей, очищенных от дрожжей Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18, 19. ДНК оригами основе моторных ансамблей были исследованы с использованием рекомбинантных кинезин15 и dynein7,8,18 конструкций, произведенных в этой системе выражения дрожжей16 ,17,18,19. Этот протокол действителен для этих конструкций, учитывая, что они контролируются галактозой индуцированного промоутера, и сливается с теми же теги белка для очистки (я и TEV протеазы связующее) и для спряжения олиго ДНК (SNAPtag).
Специфические штаммы дрожжей производят специфические конструкции двигателя. Например, динейн, используемый для изучения роли соответствия груза, очищался от штамма RPY10847,8. В целом, штаммы, содержащие моторные конструкции с соответствующими генетическими модификациями для выражения и очистки, могут быть запрошены у лабораторий, опубликовав использование этих двигателей. Конструкции с новыми атрибутами, такими как мутации или теги, могут быть сделаны с использованием рекомбинантных генетических методов, таких как преобразование литий-ацетата21 и коммерческие наборы. Подробные протоколы для создания модифицированных моторных белков в дрожжах для одного исследования молекулы были опубликованы19. В дополнение к двигателям, слитым в СНАПтаг, олиго, используемые для маркировки двигателей, должны быть спряжены с субстратом SNAP, бензилгуанином (БГ); ранее опубликованные протоколы описывают формирование и очищение BG-oligo конъюгирует18. Общая стратегия, описанная здесь, также используется для двигателей на основе actin (см. предыдущие работы для примеров22,23,24),и двигателей, очищенных от других организмов и систем выражения (см. предыдущий работает для примеров7,9,10,11,12,13,14).
Полимеризованные микротрубочки (МТ) используются в этих экспериментах в двух различных процедурах. MT сродство очистки функциональных двигателей требует MTs, которые не помечены с другими функциональными группами, в то время как двигательно-ансамбльподвижность TIRF ассс требует MTs помечены биотин и фторофоры. Во всех случаях, MTs стабилизируются с таксолом для предотвращения денатурации. Шаг очистки сродства MT используется для удаления любых не-мотиловых двигателей с высоким сродством МТ, так как эти двигатели могут изменить подвижность ансамбля, если они спрягиваются к шасси. Во время этого процесса активные двигатели отвязывают МТ и остаются в растворе, в то время как плотные связывающие двигатели вращаются в гранулах Mt. Это помогает гарантировать, что все двигатели на шасси от активной популяции.
Разнообразие структур ДНК оригами были использованы для изучения цитоскелетных двигательных ансамблей. По мере того как механистическое понимание ансамблевого транспорта росло, структуры ДНК оригами, используемые в экспериментах, росли в сложности. В принципе, любая структура может быть адаптирована для этой цели при условии, что она будет изменена, чтобы включить одноцепочечные участки вложения ДНК для двигателей и фторфоров. Конкретные конструкции шасси и атрибуты могут быть полезны для зондирования конкретных вопросов о возникающих поведение двигателей ансамблей. Например, жесткие стержни были использованы для разработки основополагающих знаний о том, как номер копий влияет на транспортировку командами динейнов и кинезинов7,15,18,и 2D платформы были использованы для изучения миозина ансамбля навигация актинских сетей22. Структуры с переменной или настраиваемой гибкостью были использованы для понимания роли эластичного соединения между двигателями и для зондирования того, как синхронизация шага влияет на подвижность8,24. В последнее время сферические структуры используются для получения информации о том, как геометрические ограничения на привязку двигателя влияют на динамику подвижности25.
В этом протоколе мы предлагаем конкретные шаги для ансамблевых экспериментов на сегментированном шасси с переменной жесткостью. Связывание сайтов на шасси иногда называют “ручками”, в то время как дополнительные последовательности ДНК, которые связывают эти ручки, называются “антиручками”. Количество двигателей на этих шасси определяется тем, какие сегменты содержат расширенные скобы рукоятки с дополнением к антихендному олиго на олиго-маркированных двигателях. Использование различных последовательностей рукояток на разных сегментах позволяет привязывать различные типы двигателей к определенным местам на шасси. Подробное здесь шасси состоит из 7 последовательных жестких сегментов, каждый из которых состоит из 12 двухцепочечных сипов ДНК, расположенных в 2 концентрическихкольцах 8. Строгие сегменты содержат моторные ручки и соединены через области, которые могут быть либо гибкой одноцепочечной ДНК или жесткой двухцепочечной ДНК, в зависимости от отсутствия или присутствия, соответственно, “связующих” скобы. Соответствие конструкции шасси, таким образом, определяется наличием или отсутствием этих “связных” скобок. Смотрите предыдущие отчеты для получения более подробной информации и конкретных последовательностей ДНК8. Кроме того, несколько методов могут быть использованы для очистки шасси26. Здесь описан метод центрифугации градиции тарифного зонального глицерола27.
Protocol
Representative Results
Discussion
Молекулярные методы строительства ДНК оригами обеспечивают уникальный способ построения моторных ансамблей с определенными архитектурами, моторными номерами и типами, что позволяет проводить исследования того, как возникающие поведение возникает из конкретных конфигураций двигат?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим К. Чау, Дж.Моргана и А. Бурлера-Коланджело за вклад в технологии сегментированного шасси ДНК оригами. Мы также благодарим бывших сотрудников лабораторий Рек-Петерсона и Ши за полезные обсуждения и вклад в первоначальное развитие этих методов. Мы благодарим J. Wopereis и Смит колледж Центр микроскопии и визуализации и Л. Bierwert и Смит колледж Центр молекулярной биологии. Мы с благодарностью отмечаем программу NSF MRI для приобретения микроскопа TIRF.
Materials
| 2 mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure | Cytoskeleton.com | T333P-A | |
| Biotin-BSA | Sigma | A8549-10MG | |
| Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm | Beckman Coulter | 356013 | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm | Beckman Coulter | 355603 | |
| Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC30VV00 | |
| IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL | GE Healthcare | 17096901 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty | Bio-Rad | 7326204EDU | |
| P8064 Scaffold | Tilibit | 2 mL at 400nM | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProTev Protease | Promega | V6101 | |
| Scotch Double Sided Tape with Dispenser | amazon.com | N/A | |
| Sephacryl S-500 HR | GE Healthcare | 17061310 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher | 434302 | |
| SYBR Safe DNA stain | Invitrogen | ||
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton.com | T240-B | |
| Tubulin, HiLyte 647 | Cytoskeleton.com | TL670M-A | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 344090 |
Riferimenti
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
- Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).
- Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. Functions and mechanics of dynein motor proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).
- Hancock, W. O. The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus. Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).
- McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. Collective dynamics of processive cytoskeletal motors. Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).
- Hancock, W. O. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).
- Derr, N. D., et al. Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science. 338 (6107), 662-665 (2012).
- Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing. Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).
- Torisawa, T., et al. Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).
- Urnavicius, L., et al. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).
- Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).
- Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).
- Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load. Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).
- Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
- Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin. eLife. 3, e02641 (2014).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).
- Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Engineering defined motor ensembles with DNA origami. Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).
- Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).
- Qiu, W., Derr, N. D., et al. Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).
- Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).
- Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).
- Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles. The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).
- Hariadi, R. F., et al. Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments. Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).
- Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles. Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).
- Wagenbauer, K. F., et al. How We Make DNA Origami. Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).
- Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices. Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
- Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. Handbook of Dynein. , (2019).
- Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
