Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Summary

Målet med denne protokol er at danne ensembler af molekylære motorer på DNA origami nanostrukturer og observere ensemblet motilitet ved hjælp af total intern refleksion Fluorescens mikroskopi.

Abstract

Cytoskelet motorer er ansvarlige for en bred vifte af funktioner i eukaryote celler, herunder mitose, fragt transport, cellulære motilitet, og andre. Mange af disse funktioner kræver, at motorerne opererer i ensembler. På trods af et væld af viden om mekanismerne i individuelle cytoskelet motorer, forholdsvis mindre er kendt om mekanismerne og emergent opførsel af motor ensembler, eksempler på som omfatter ændringer i ensemble processivitet og hastighed med ændring af motor nummer, placering og konfiguration. Strukturel DNA nanoteknologi, og den specifikke teknik af DNA origami, muliggør Molekylær opførelse af veldefinerede arkitekturer af motor ensembler. Formen af laste strukturer samt type, antal og placering af motorer på strukturen kan alle styres. Her giver vi detaljerede protokoller til fremstilling af disse ensembler og observere dem ved hjælp af total intern refleksion Fluorescens mikroskopi. Selv om disse teknikker er blevet specifikt anvendt til cytoskelet motorer, metoderne er generaliserbart til andre proteiner, der samles i komplekser til at udføre deres opgaver. Samlet set, DNA origami metode til at skabe veldefinerede ensembler af motor proteiner giver et kraftfuldt værktøj til at dissekere de mekanismer, der fører til emergent motile sædceller adfærd.

Introduction

Dynein og kinesin er cytoskeletale motor proteiner, der er ansvarlige for myriader af funktioner i eukaryote celler¹. Ved at omdanne den kemiske energi af ATP hydrolyse til produktivt arbejde, translokerer disse motorer på mikrotubuler til at trække og distribuere forskellige intracellulære Cargos. De koordinerer også i de massive intracellulære rearrangementer forbundet med mitose, hvor de udviser orkestret kræfter, der bidrager til positionering og adskillelse af kromosomer. Strukturelle, biokemiske og biofysiske analyser, herunder observationer af det enkelte molekyle, har afsløret mekanismerne for disse motorer på individuelt niveau (gennemgået i tidligere værker^2,3,4). Mange af motorernes opgaver kræver imidlertid, at de arbejder i små ensembler af både lignende og blandede motortyper. Forholdsvis mindre er forstået om de mekanismer, der koordinerer aktiviteten og den ultimative emergent motilitet af disse ensembler^5,6. Denne videnkløft skyldes til dels vanskeligheden ved at skabe ensembler med kontrollerbare funktioner, såsom motortype og kopi nummer. I løbet af det seneste årti, har den molekylære konstruktion teknikker af DNA origami været ansat til at løse dette problem. For de mikrotubulære baserede motorer omfatter nogle eksempler på disse undersøgelser enkelt molekyle observationer af ensembler af cytoplasmisk dynein-1^7,8,9, intraflagellar dynein¹¹, forskellige kinesin-motorer^12,13og blandinger af både dyneiner og kinesiner^7,14,15. Her giver vi oplysninger om rensning og oligonukleotid mærkning af motorer fra gær^{7,16,17,18,19,20}, foldning og rensning af segmenteret DNA-origami med tunbar overholdelse⁸, og billeddannelse af gærmotorer, som fremdriver chassis strukturerne^7,18.

Konstruere motor ensembler til in vitro enkelt molekyle observation kræver tre primære indsats. Den første er udtrykket, rensning og mærkning af motorkonstruktioner egnet til fastgørelse til DNA origami. Den anden er produktion og rensning af definerede DNA origami strukturer (ofte betegnet “chassis”). Og den tredje er konjugation af motorerne til chassis struktur efterfulgt af observation ved hjælp af total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Her giver vi etablerede protokoller for denne proces for rekombinante microtubule-baserede motorer renset fra gær Saccharomyces cerevisiae^{7,16,17,18, 19}. DNA-origami-baserede motor ensembler er blevet undersøgt ved hjælp af både rekombinant kinesin¹⁵ og dynein^7,8,18 konstruktioner produceret i dette gærekspressions system^{16 ,17,18,19}. Denne protokol gælder for disse konstruktioner, da de styres af den galactoseinducerede promotor og sammensmeltet med de samme protein Tags til rensning (ZZ og TEV proteaselinker) og til DNA-oligo konjugering (SNAPtag).

Specifikke gærstammer producerer specifikke motoriske konstruktioner. For eksempel, dynein bruges til at studere rollen af lasten overholdelse blev renset fra stamme RPY1084^7,8. Generelt kan der anmodes om stammer, som indeholder motorkonstruktioner med passende genetiske modifikationer til ekspression og rensning, fra de laboratorier, der har offentliggjort brugen af disse motorer. Konstruktioner med nye egenskaber såsom mutationer eller Tags kan laves ved hjælp af rekombinante genetiske teknikker, såsom lithium acetat transformation²¹ og kommercielle kits. Detaljerede protokoller til oprettelse af modificerede motor proteiner i gær til enkelt molekyle studier er blevet offentliggjort¹⁹. Ud over de motorer, der er smeltet til snaptag, skal oligonukleotider anvendes til at mærke motorerne være konjugeret til snap substrat, benzylguanin (BG); tidligere udgivne protokoller beskriver dannelsen og rensningen af BG-oligo-konjugater¹⁸. Den overordnede strategi, der er beskrevet her, har også været anvendt til actin-baserede motorer (Se tidligere værker for eksempel^22,23,24) og motorer renset fra andre organismer og udtryks systemer (Se tidligere værker for eksempel^{7,9,10,11,12,13,14}).

Polymeriserede mikrotubuler (MTs) anvendes i disse eksperimenter i to forskellige procedurer. MT affinitet rensning af funktionelle motorer kræver MTS, der ikke er mærket med andre funktionelle grupper, mens motor-ensemble motilitet tirf assay kræver MTS mærket med biotin og fluorophores. I alle tilfælde, MTs er stabiliseret med Taxol for at forhindre denaturering. MT Affinity oprensnings trinnet bruges til at fjerne alle ikke-motile motorer med en høj MT affinitet, da disse motorer kan ændre ensemble motilitet, hvis det bøjes til et chassis. Under denne proces frigør de aktive motorer MTs og forbliver i opløsning, mens stram-bindende motorer spinne ned i MT pellet. Dette hjælper med at sikre, at alle motorer på chassiset er fra en aktiv population.

En række DNA origami strukturer er blevet brugt til at studere cytoskelet motor ensembler. Som den mekanistiske forståelse af ensemble transport er steget, DNA origami strukturer ansat i eksperimenter er vokset i kompleksitet. I princippet kan enhver struktur tilpasses til dette formål, forudsat at den er modificeret til at omfatte enkeltstrenget DNA-fastgørelses steder for motorer og fluorophorer. Specifikke chassis design og egenskaber kan være nyttige til at prøve særlige spørgsmål om motor ensembler emergent opførsel. For eksempel er stive stænger blevet brugt til at udvikle fundamentale viden om, hvordan kopi nummer påvirker transport af hold af dyneiner og kinesiner^7,15,18, og 2D platforme er blevet brugt til at studere myosin ensemble navigation af actin-netværk²². Strukturer med variabel eller tunbar fleksibilitet er blevet brugt til at forstå rollerne af elastisk kobling mellem motorer og til at sonde, hvordan stepping synkronisering påvirker motilitet^8,24. For nylig bruges sfæriske strukturer til at få indblik i, hvordan geometriske begrænsninger af motor-track bindingen påvirker dynamikken i motilitet²⁵.

I denne protokol tilbyder vi specifikke trin til ensemble eksperimenter på segmenteret chassis med variabel stivhed. Bindingssteder på chassiset omtales sommetider som “håndtag”, mens komplementære DNA-sekvenser, der binder disse håndtag, betegnes som “anti håndtag”. Antallet af motorer på disse chassiser bestemmes af, hvilke segmenter der indeholder udvidede håndtag, med komplementaritet til antihåndtaget oligo på de oligo-mærkede motorer. Ved hjælp af forskellige håndtag sekvenser på forskellige segmenter giver mulighed for binding af forskellige typer af motorer til specifikke steder på chassiset. Chassiset, der er beskrevet her, består af 7 sekventielle stive segmenter, der hver består af 12 dobbeltstrengede DNA-skruelinjer arrangeret i 2 koncentriske ringe⁸. De stive segmenter indeholder motor håndtag og er forbundet gennem regioner, der kan være enten fleksibelt enkeltstrenget DNA eller stiv dobbeltstrenget DNA, afhængigt af fravær eller tilstedeværelse af henholdsvis “linker” hæfteklammer. Chassis strukturens overensstemmelse bestemmes således af tilstedeværelsen eller fraværet af disse “linker” hæfteklammer. Se tidligere rapporter for yderligere oplysninger og specifikke DNA-sekvenser⁸. Desuden kan flere metoder bruges til at rense chassis²⁶. Den hastighed-Zonal glycerol gradient Centrifugerings metode²⁷ er beskrevet her.

Protocol

1. vækst, ekspression og høst af motor proteiner, der styres af en galactose induceret promotor Ved hjælp af en gær-peptone-dextrose (YPD) kultur plade og en steril inokulerende pind, stribe ønskede frosne gær stamme og inkubere i 3-4 dage ved 30 °C. Dag 1 i kultur vækst: om eftermiddagen tilsættes 10 mL YP-kultur medier med 2% dextrose til et glas kulturrør med 1 “diameter og inokulerer det med en enkelt koloni fra pladen. Vokse i en hurtigt roterende tromle ved 30 °C natten over. <l…

Representative Results

Vellykkede rensninger af motorer og chassis konstruktioner blev analyseret af gel elektroforese. SDS-Sideanalyse bekræftede den vellykkede udvinding af dynein fra gær (figur 2), da det endelige filtrat indsamlet i trin 2.3.7 viste et klart, skarpt bånd ved positionen ~ 350 kDa. Som forventet var dette dynein-bånd fraværende fra strømning og Wash, der fjernede uønskede proteiner, og perlerne, hvorfra dynein blev kløvet. Observationen antyder, at IgG af…

Discussion

De molekylære konstruktionsteknikker for DNA-origami giver en unik måde at konstruere motor ensembler med definerede arkitekturer, motor numre og typer, der muliggør undersøgelser af, hvordan emergent opførsel opstår fra specifikke motorkonfigurationer³¹. Som strukturelle og cellulære undersøgelser fortsætte med at belyse eksempler på cytoskelet motorer arbejder i teams, teknikker til isolering og undersøge de biofysiske og biokemiske mekanismer af motorer i ensembler vokser i nytte. Fo…

Materials

2 mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pure	Cytoskeleton.com	T333P-A
Biotin-BSA	Sigma	A8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mm	Beckman Coulter	356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mm	Beckman Coulter	355603
Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mL	GE Healthcare	17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, empty	Bio-Rad	7326204EDU
P8064 Scaffold	Tilibit	2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography Columns	Bio-Rad	731-1550
ProTev Protease	Promega	V6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenser	amazon.com	N/A
Sephacryl S-500 HR	GE Healthcare	17061310
Streptavidin	Thermo Fisher	434302
SYBR Safe DNA stain	Invitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain	Cytoskeleton.com	T240-B
Tubulin, HiLyte 647	Cytoskeleton.com	TL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge Tubes	Beckman Coulter	344090