使用天然多酚姜黄素对脑组织淀粉样斑块进行标记和成像
Summary
姜黄素是一种理想的荧光素，用于标记和成像脑组织中的淀粉样贝塔蛋白斑块，因为它优先结合淀粉样贝塔蛋白，并且与其他传统的淀粉样蛋白结合染料的结构相似。与传统方法相比，它可用于更高效、更廉价地标记和图像淀粉样β蛋白斑块。
Abstract
淀粉样β蛋白（A+）在细胞外和细胞内空间沉积是阿尔茨海默氏病（AD）的显著疾病之一。因此，检测AD脑组织中A+的存在是开发新的治疗方法，防止AD进展的宝贵工具。几种经典的淀粉样结合染料、氟铬、成像探针和A+特异性抗体已用于检测AD脑组织中的A+组织。使用这些化合物进行A+检测既昂贵又耗时。然而，由于其强烈的荧光活性，高亲和力，和特殊性A+，以及结构相似性，传统的淀粉样结合染料，姜黄素（Cur）是一个有前途的候选标签和成像A+斑块在死后脑组织。它是来自草本姜黄龙的天然多酚。在本研究中，Cur在一分钟内从5倍家族性阿尔茨海默氏病（5xFAD）的遗传小鼠模型和人类AD组织中，用组织化学方式标记A+斑块。Cur 的标签能力与传统的淀粉样结合染料（如硫黄素-S（硫黄素-S）、刚果红 （CR） 和氟玉 C （FJC） 以及 A+ 特异性抗体 （6E10 和 A11）进行了比较。我们观察到，与这些传统染料相比，Cur 是最廉价、最快速的标记和图像 A+ 斑块的方法，与 A+ 特异性抗体相媲美。此外，Cur 与大多数 A+ 物种结合，如寡聚物和纤维蛋白。因此，Cur 可用作 A+ 斑块最经济、简单、快速的氟铬检测剂。
Introduction
阿尔茨海默氏病（AD）是最常见的、与年龄有关、渐进的神经系统疾病之一，也是全球1、2日死亡的主要原因之一。学习、记忆和认知障碍，以及神经精神障碍，是AD3中常见的症状。虽然AD的病因尚未完全阐明，但现有的遗传、生化和实验证据表明，A+的逐渐沉积是AD4的明确生物标志物。这种错误折叠的蛋白质积累在细胞内和细胞外空间，被认为是参与突触损失，增加神经炎症，和神经退化在受AD5影响的大脑的皮质和海马区域。因此，在AD组织中组织化学检测A+是开发无毒抗淀粉样药物以防止AD进展的关键的第一步。
在过去的几十年中，许多研究实验室使用几种染料和抗体来标记和图像脑组织中的 A+ 斑块，但其中一些方法耗时，使用的染料或抗体昂贵，需要多种附件化学品。因此，开发一种廉价的方法来检测AD大脑中的A+斑块将是一个受欢迎的新工具。许多实验室开始使用Cur，一种有前途的抗淀粉样天然多酚，用于标记和成像A+，以及AD6，7，8，9的治疗剂。其疏水性和嗜血性性质、与经典淀粉样结合染料的结构相似性、强大的荧光活性以及与 A+ 结合的强烈亲和力使其成为 AD 组织 10 中 A+ 斑块标记和成像的理想荧光素.Cur与A+斑块和寡聚物结合，其存在也在细胞内空间7，11，12，13中检测到。此外，已经表明，最小量（1⁄10 nM）的Cur可以标记A+斑块在5倍家族性阿尔茨海默氏病（5xFAD）脑组织7。虽然 1 nM 浓度不能为 A+ 斑块计数提供最佳荧光强度，但 Cur 的浓度为 10 nM 或更高。Ran和他的同事14日报告说，剂量低至0.2 nM的二氟龙衍生的Cur几乎可以检测体内A+沉积物和红外探头。此剂量是否足以标记组织中的 A+ 斑块仍不清楚。以前的大多数研究都使用 20-30 分钟使用 Cur 染色 A+ 斑块，但最佳染色可能需要的时间要少得多。
本研究旨在测试 Cur 在 AD 脑组织中标记 A+ 斑块所需的最短时间，并比较 5xFAD 小鼠在与其他常规小鼠染色后，在脑组织中标记和成像 A+ 斑块的灵敏度A+ 结合染料，如硫黄素-S（硫-S）、刚果红 （CR） 和氟-玉 C （FJC）。这些经典淀粉样结合染料的A+标记能力与5xFAD小鼠和年龄匹配的人类AD和控制脑组织的石蜡嵌入和冷冻冠状脑部分的Cur染色进行了比较。研究结果表明，Cur以类似于A+特异性抗体（6E10）的方式标记A+斑块，并比Thio-S、CR或FJC中更好。此外，当Cur到5xFAD小鼠的腹内注射被注射2~5天时，它越过了血脑屏障，并与A+斑块7结合。有趣的是，在5xFAD脑组织7，14中，纳米摩尔浓度已经被用来标记和图像A+斑块。此外，形态上截然不同的A+斑块，如核心、神经质、扩散和烧坏斑块，可以比任何其他传统的淀粉样结合染料7更高效地标记Cur。总体而言，Cur 可以以简单且廉价的方式应用于 AD 动物模型和/或人类 AD 组织死后脑组织中的 A+ 斑块的标签和图像，作为 A+ 特异性抗体的可靠替代品。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们的假设是，与其他经典淀粉样结合染料以及 A+ 特异性抗体相比，Cur 可用作在死后 AD 脑组织中标记和图像 A+ 斑块的最快速、最简单和最便宜的方法。本研究的目的是确定Cur在死后AD脑组织中标记和图像A+斑块所需的最短时间，并确定Cur是否可以作为A+抗体的替代物来标记A+斑块。为此，在不同时间点观察到Cur的A+标记能力。Cur 能够在一分钟内将 A+ 贴上标签。此外，Cur 对 A+ 的标记大于其他常规?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究的支持来自圣玛丽阿森松的菲尔德神经科学研究所。
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1×70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
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