인간 배아 줄기 세포에서 뇌 오르가노이드를 생성하기위한 정적 자기 지향 방법
Summary
이 프로토콜은 여전히 뇌 세포 유형과 세포 조직의 많은 기능의 다양성을 유지하면서 외인성 성장 인자 또는 지하 막 매트릭스없이 단순화, 저렴한 비용으로 뇌 오르가노이드를 생산하는 수단으로 생성되었다.
Abstract
배아 줄기 세포에서 분화된 인간의 뇌 오르가노이드는 3차원 시스템에서 여러 세포 유형의 복잡한 상호 작용을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 여기에서 우리는 두뇌 오르가노이드를 산출하는 상대적으로 간단하고 저렴한 방법을 제시합니다. 이 프로토콜에서 인간 다능성 줄기 세포는 단일 세포 대신 작은 클러스터로 분해되고 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자없이 기본 매체에서 성장하여 본질적인 발달 단서를 형성할 수 있게 합니다. 오르가노이드의 성장. 이 간단한 시스템은 신경교 세포와 미세 교세포, 줄기 세포 및 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌의 뉴런을 포함한 다양한 뇌 세포 유형을 생성합니다. 이 프로토콜에서 생성된 오르가노이드는 또한 브라이트필드 이미지, 조직학, 면역형광 및 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 입증된 적절한 시간및 공간 조직의 특징을 표시합니다. qRT-PCR)을 참조하십시오. 이 오르가노이드는 두뇌의 각종 부분에서 세포 모형을 포함하기 때문에, 그(것)들은 질병의 다수를 공부를 위해 이용될 수 있습니다. 예를 들면, 최근 논문에서 우리는 인간 두뇌에 저산소증의 효력을 공부하기 위한 이 프로토콜에서 생성된 organoids의 사용을 설명했습니다. 이 접근법은 신경 발달 장애, 유전 장애 및 신경질환과 같은 조건을 연구하기 어려운 배열을 조사하는 데 사용될 수 있다.
Introduction
무수 한 실용적이 고 윤리적제한으로 인해 인간의 뇌를 연구하는 데 많은 어려움이 있었습니다. 설치류를 이용한 연구는 인간의 뇌에 대한 우리의 이해에 중요했지만, 마우스 뇌는 많은비유사성1,2. 흥미롭게도, 마우스는 영장류뇌보다적어도 7배 적은 뉴런 밀도를 가지고3,4. 영장류는 진화적 관점에서 설치류보다 인간에 더 가깝지만 대부분의 연구자들은 그들과 함께 일하는 것은 실용적이지 않습니다. 이 프로토콜의 목적은 뇌 세포 다양성과 세포 조직을 유지하면서 이종 지하 막 매트릭스 또는 외인성 성장 인자를 필요로하지 않고 단순화되고 저렴한 방법을 사용하여 인간 뇌의 많은 중요한 기능을 재량화하는 것이었습니다.
Sasai 실험실에서 조형 작업은 신호화 된 배아 줄기 세포 (ESCs)에서 2 차원 및 3 차원 신경 세포 유형을 생성하는 배아 체의 혈청 무료 배양 법을 사용5,6. 많은 인간의 뇌 오르가노이드 방법은 신호화된 ESCs7,8에서비교적 유사한 경로를 따랐습니다. 대조적으로, 이 프로토콜은 분리된 인간 ESCs(hESCs)의 클러스터로 시작하며, 도금 단계9,10뿐만 아니라 외인성 성장 인자(11)를 첨가하기 전에 파스카 실험실의 뇌 오르가노이드 프로토콜의 초기 단계인 톰슨 및 장 실험실의 정액 작업의 초기 단계와 유사하게 시작한다. 지하막 매트릭스(예를 들어, 마트리겔)는 많은 뇌 오르가노이드 프로토콜에 활용되어 왔으며 효과적인 스캐폴드8로나타났다. 그러나, 가장 일반적으로 사용되는 지하 막 매트릭스는 생산12동안 배치 가변성에 배치와 성장 인자의 알 수없는 수량과 공동 으로 공동 으로 합병증없이 오지 않는다. 또한 이러한 행렬은 이미징을 복잡하게 하고 오염 및 비용의 위험을 증가시킬 수 있습니다.
인간의 뇌 오르가노이드는 많은 질문에 대답하는 데 사용할 수 있지만, 염두에 두어야 할 특정 한계가 있습니다. 하나는, 배아 줄기 세포에서 시작, 오르가노이드는 더 밀접하게 노화 뇌보다 미성숙 한 뇌를 닮은 등 알츠하이머 병과 같은 노년기에 발생하는 질병에 대한 이상적인 모델이 아닐 수 있습니다. 둘째, 우리의 프로토콜은 여러 뇌 영역에서 세포에 대한 치료 또는 질병의 효과를 연구하는 데 유용한 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌 발달의 마커를 발견했지만, 다른 프로토콜은 특정 뇌 영역에 집중하기 위해 따를 수 있다13,14. 마지막으로, 오르가노이드 모델의 또 다른 제한은 크기의 반면, 인간의 뇌의 평균 길이는 약 167 mm, 교반의 사용으로 만든 뇌 오르가노이드는 4mm8까지 성장하고이 프로토콜에 의해 형성 된 오르가노이드는 1-2mm로 10 주까지 증가합니다. 그럼에도 불구 하 고, 이 프로토콜은 인간의 뇌 조직 및 여러 세포 유형의 상호 작용을 연구 하는 중요 한 도구를 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다른 오르가노이드 모델과 마찬가지로, 이것은 몇 가지 주의 사항이 있는 인공 시스템입니다. 전반적인 발현 수준 면에서 배치 변형에 대한 배치는 거의 없었지만 개별 오르가노이드는 차이를 보였습니다. 예를 들어, Sox-2 양성 영역의 위치는 모든 오르가노이드에서 동일하지않았다(그림 3). qPCR은 세포의 배치에 있는 전반적인 변경을 찾아내기 적당하는 동안, 단세포 RNAseq와 같은 추?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
예일 줄기세포 코어(YSCC)와 예일암센터(YCC)에 도움을 주셔서 감사합니다. 그의 신경병리학 적 검토에 대한 김정박사에게 감사드립니다. 이 작품은 코네티컷 재생 의학 연구 기금에 의해 지원되었다, Dimes의 행진, NHLBI R01HL131793 (S.G.), 예일 암 센터와 예일 암 생물학 교육 프로그램 NCI CA193200 (E.B.) 조셉과 루실 매드리.
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
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