En statisk självstyrd metod för att generera hjärnorganoider från mänskliga embryonala stamceller

Summary

Detta protokoll genererades som ett sätt att producera hjärnan organoider på ett förenklat, lågt kostnadssätt utan exogena tillväxtfaktorer eller källaren membran matris samtidigt som mångfalden av hjärnan celltyper och många funktioner i cellulära organisation.

Abstract

Mänskliga hjärnorganoider differentierade från embryonala stamceller erbjuder en unik möjlighet att studera komplicerade interaktioner mellan flera celltyper i ett tredimensionellt system. Här presenterar vi en relativt enkel och billig metod som ger hjärnan organoider. I detta protokoll mänskliga pluripotenta stamceller är uppdelade i små kluster i stället för enstaka celler och odlas i grundläggande medier utan en heterolog källare membran matris eller exogena tillväxtfaktorer, så att den inneboende utvecklingssignaler att forma den organoidens tillväxt. Detta enkla system producerar en mångfald av hjärncelltyper inklusive glia- och mikrogliala celler, stamceller och nervceller i framhjärnan, mellanhjärnan och hindbrain. Organoider som genereras från detta protokoll visar också kännetecken för lämplig tids- och rumslig organisation som demonstreras av brightfield bilder, histologi, immunfluorescens och kvantitativa omvänd transkriptionspolymerasreaktion i realtid ( qRT-PCR). Eftersom dessa organoider innehåller celltyper från olika delar av hjärnan, de kan användas för att studera en mängd sjukdomar. Till exempel, i en nyligen papper visade vi användningen av organoider som genereras från detta protokoll för att studera effekterna av hypoxi på den mänskliga hjärnan. Detta tillvägagångssätt kan användas för att undersöka en rad annars svåra att studera tillstånd såsom neurodevelopmental handikapp, genetiska sjukdomar, och neurologiska sjukdomar.

Introduction

På grund av otaliga praktiska och etiska begränsningar har det varit stora svårigheter att studera den mänskliga hjärnan. Medan studier som använder gnagare har varit avgörande för vår förståelse av den mänskliga hjärnan, har mushjärnan många skillnader^1,2. Intressant, möss har en neuronal densitet som är minst 7 gånger mindre än primathjärnan^3,4. Även primater är närmare människor än gnagare ur evolutionär synvinkel, är det inte praktiskt för de flesta forskare att arbeta med dem. Syftet med detta protokoll var att sammanfatta många viktiga funktioner i den mänskliga hjärnan med hjälp av en förenklad och billigare metod utan behov av en heterolog källare membran matris eller exogena tillväxtfaktorer samtidigt som hjärnans cell mångfald och cellulära organisation.

Formativt arbete från Sasai labbet använde serumfri kultur av embryoid organ (SFEBq) metod för att generera två- och tredimensionella neuronala celltyper från signaliserade embryonala stamceller (ESCs)^5,6. Många mänskliga hjärnan organoid metoder har följt en relativt liknande väg från signaliserade ESCs^7,8. Däremot börjar detta protokoll med kluster av fristående mänskliga ESCs (hESCs), liknande de första stegen i nyskapande arbete thomson och Zhang laboratorier före plätering steg^9,10 samt det ursprungliga steget i hjärnan organoid protokoll pasca laboratoriet innan tillsats av exogena tillväxtfaktorer¹¹. Källare membran matriser (t.ex. matrigel) har använts i många hjärnan organoid protokoll och det har visat sig vara en effektiv byggnadsställning⁸. Emellertid, oftast används källare membran matriser kommer inte utan komplikationer eftersom de samrena med okända mängder tillväxtfaktorer med parti till batch variabilitet under produktion¹². Dessutom kan dessa matriser komplicera bildbehandling, och öka risken för kontaminering och kostnad.

Medan mänskliga hjärnan organoider kan användas för att svara på många frågor, Det finns vissa begränsningar att tänka på. För en, från embryonala stamceller, organoider mer liknar omogna hjärnor än åldern hjärnor och som sådan kanske inte är idealiska modeller för sjukdomar som uppstår i ålderdomen, som Alzheimers sjukdom. För det andra, medan vårt protokoll hittade markörer för framhjärnan, midbrain och hindbrain utveckling som är användbara för att studera effekten av en behandling eller sjukdom på celler från flera hjärnregioner i samförstånd, andra protokoll kan följas för att koncentrera sig på specifika hjärnregioner^13,14. Slutligen, en annan begränsning av organoid modeller är att av storlek, medan den genomsnittliga längden på en mänsklig hjärna ca 167 mm, hjärnan organoider som gjorts med hjälp av agitation växa upp till 4 mm⁸ och organoider som bildas av detta protokoll växa till 1-2 mm med 10 veckor. Icke desto mindre, detta protokoll ger ett viktigt verktyg för att studera mänskliga hjärnvävnad och samspelet mellan flera celltyper.

Protocol

1. Stamcellsunderhåll Underhåll H9 hESCs på ett lager av tillväxtfaktor minskad källare membran matris (se tabellen över material,hädanefter helt enkelt kallad matris) enligt tillverkarens instruktioner. För att belägga en 6-brunn tallrik eller en 10 cm maträtt, kombinera 100 μL matris med 5,9 ml iskall Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) / F12 media. Wrap plattor i paraffin film och lagra över natten vid 4 ° C. Använd dem nästa dag för passaging celler efter övers…

Representative Results

Bild 1 visar representativa brightfield bilder av flera tidpunkter för att visa hur cellerna / organoider ser ut i hela de olika stadierna av protokollet. HESCs avlägsnades från vävnadsodlingsplattan, bröts i små bitar och placerades i en T75 ultralåg fastsättningskolv där de bildade sfärer. Det är viktigt att notera att cellerna ser ljusa och liknande i storlek, utan mörka, döende celler i mitten av dessa kluster. Cellerna avvejkades gradvis av bFGF. På dag 5 placerades de i n…

Discussion

Liknar andra organoid modeller, Detta är ett artificiellt system som kommer med flera varningar. Även om det fanns lite parti till batch variation när det gäller övergripande uttrycknivåer, enskilda organoider uppvisade skillnader. Till exempel var placeringen av Sox-2 positiva områden inte identiska i varje organoid(figur 3). Medan qPCR är lämplig att leta efter övergripande förändringar i partier av celler, ytterligare tekniker såsom single cell RNAseq kommer att användas i framtida studi…

Materials

Alexa Fluor 488 goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11029
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	A11035
B27 Supplement	Gibco, Waltham, MA, USA	17504-044
bFGF	Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	PHG0263
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647
BX43 microscope	Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan
DAPI stain	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	D1306
Dispase	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	07913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11330-032
DPBS	Gibco, Waltham, MA, USA	10010023
FluroSave	MilliporeSigma, Burlington, MA	345789
GFAP antibody	NeuroMab, Davis, CA	N206A/8
Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)	Corning, Corning, NY, USA	356231
H9 hESCs	WiCell, Madison, WI, USA	WA09
Heparin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	9041-08-1
iQ SYBR Green Supermix	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708880
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	1708891
L-glutamine	Gibco, Waltham, MA, USA	25030-081
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M6145
mTESR media	STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada	85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA	400-163
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	ND-2000
NEAA	Gibco, Waltham, MA, USA	11140-050
Normal Donkey Serum (NDS)	ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA	017-000-121
OCT	Sakura Finetek, Torrance, CA, USA	25608-930
PFA	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	RT15710
qPCR machine	Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA	1855196
RNeasy kit	Qiagen, Hilden, Germany	74104
Sox2	MilliporeSigma, Burlington, MA	AB5603
TMS-F microscope	Nikon, Melville, NY, USA
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787-100ML
Ultra-low attachment T75 flasks	Corning, Corning, NY, USA	3814