Dinamica di oligomerizzazione dei recettori delle superfici cellulari nelle cellule viventi mediante microscopia a fluorescenza totale di riflessione interna combinata con l'analisi del numero e della luminosità

Sommario

Descriviamo un approccio di imaging per la determinazione dello stato oligomerico oligomerico medio degli oligomeri mEGFP-tagged-receptor indotti dal legame del ligando nella membrana plasmatica delle cellule viventi. Il protocollo si basa sulla microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) combinata con l'analisi di Number and Brightness (N&B).

Abstract

Nonostante l'importanza e l'ubiquità dell'oligomerizzazione del recettore, pochi metodi sono applicabili per rilevare gli eventi di clustering e misurare il grado di clustering. Qui, descriviamo un approccio imaging per determinare lo stato oligomerico medio degli omocomplessi del recettore mEGFP nella membrana delle cellule viventi. Il protocollo si basa sulla microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) combinata con l'analisi di Number and Brightness (N&B). N&B è un metodo simile alla spettroscopia fluorescenza-correlazione (FCS) e all'istogramma di conteggio dei fotoni (PCH), che si basano sull'analisi statistica delle fluttuazioni dell'intensità della fluorescenza dei fluorofori che si diffondono dentro e fuori da un'illuminazione volume durante un periodo di osservazione. In particolare, N&B è una semplificazione del PCH per ottenere informazioni sul numero medio di proteine nelle miscele oligomeriche. Le ampiezze di fluttuazione dell'intensità sono descritte dalla luminosità molecolare del fluoroforo e dal numero medio di fluorofori all'interno del volume di illuminazione. Pertanto, N&B considera solo il primo e il secondo momento della distribuzione dell'ampiezza, vale a dire l'intensità media e la varianza. Questo è, allo stesso tempo, la forza e la debolezza del metodo. Poiché vengono considerati solo due momenti, N&B non è in grado di determinare la frazione molare degli oligomeri sconosciuti in una miscela, ma stima solo lo stato medio di oligomerizzazione della miscela. Tuttavia, può essere applicato a serie temporali relativamente piccole (rispetto ad altri metodi di momento) di immagini di cellule vive su base pixel per pixel, semplicemente monitorando le fluttuazioni temporali dell'intensità della fluorescenza. Riduce il tempo effettivo per pixel a pochi microsecondi, consentendo l'acquisizione nell'intervallo di tempo di secondi a millisecondi, che è necessario per l'oligomerizzazione rapida cinetica. Infine, è possibile esplorare grandi aree cellulari e compartimenti subcellulari.

Introduzione

Descriviamo un approccio di imaging TIRF-N&B (Total Internal Reflection Fluorescence-Number and Brightness) per determinare lo stato oligomerico medio delle molecole recettoriali alla membrana plasmatica delle cellule vive, con l'obiettivo di collegare l'assemblaggio del recettore funzione biologica delle proteine (Figura 1).

Al momento del legame del ligando extracellulare, i recettori avviano la trasduzione del segnale intracellulare a seconda della loro conformazione, oligomerizzazione, potenziali co-recettori e composizione della membrana. Nonostante l'importanza e l'ubiquità dell'oligomerizzazione del recettore, ricono....

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Primo giorno. Cellule di semi HeLa in mezzo completo ad una concentrazione di 100.000-200,000 cellule / mL in piatti in vetro-fondo. Seme 6-8 replicare piatti.
   NOT: In questo esempio, il mezzo è integrato con il 10% di calore inattivato Siero Fetale Bovino (FBS), 1 mM di pirata di sodio, 100 U/100 g di penicillina/streptomicina. Diversi piatti replicare sono preparati.
2. Giorno 2-3. Quando le cellule sono a sub-confluenza, trasfect metà dei piatti con il plasmide proteico e la seconda metà con plasmidi di riferimento (monomero e dimero), in mezzo senza siero.
   NOT: La trasfezione è fatta in....

Risultati

I risultati per due celle HeLa-mEGFP-FGFR1 rappresentative seminato nello stesso piatto di coltura sono mostrati nella Figura 5 e nella Tabella supplementare 1. Le due celle sono state catturate al momento 0 min (Figura 5A, superiore) e 7 min (Figura 5A, fondo) dopo l'aggiunta del ligando FGF2.

Discussione

N&B richiede diverse precauzioni nella scelta del modello di cella e della strategia di etichettatura. Può essere applicato solo alle cellule vive che rimangono aderenti stabilmente durante il tempo di acquisizione dell'immagine. Le fluttuazioni extra dovute allo spostamento rigido dell'intera cellula potrebbero essere gestite con approcci appropriati per il ripristino dell'immagine³⁸. Tuttavia, generalmente quando una cellula si muove, anche la membrana cellulare si deforma e la deformazione dell.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio invertito a 3 colori Fast TIRF Leica AM TIRF MC, con allineamento TIRF automatico smi. Il microscopio è dotato di un laser a diodi da 488 nm, un obiettivo TIRF in olio 100x 1,46, filtri passa-banda Ex/Em a 490/20 e 525/50, incubatore per temperatura/CO2 e telecamera EMCCD Andor DU 8285 VP. Il microscopio è gestito dal software Leica LIF.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germania
Albumina da siero bovino 98% minimo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM senza rosso fenolo con 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Siero usato senza microscopia
DMEM ad alto glucosio GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Utilizzato per il terreno completo
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, Francia	X0515-500
Sistema di suddivisione delle emissioni Fotometria DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Siero fetale bovino, qualificato, Brasile	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	10270106	Integratore inattivato al 10% per il terreno completo
Fondo in vetro 35 mm sterile 1,5 piastre	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	non rivestito, spessore del vetro 0,17 micron
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Carcinoma cervicale umano (HeLa), cellule di componenti animali (AC) prive di siero	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germania	CB_08011102
Telecamera iXonEM+ 897 EMCCD (retroilluminata) ANDOR controllata dal software ANDOR Solis	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, Regno Unito		Questa fotocamera, installata in una porta aggiuntiva del microscopio, viene utilizzata per l'acquisizione del Serie temporale B
Eseguibile Matlab N& B unità di routine	di microscopia e imaging dinamico, CNIC, Madrid, Spagna		scarica su https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillina:Streptomicina per coltura tissutale 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	integratore per mezzo a Penicillina/Streptomicina 100 U/100µg.
Vettore di espressione pN1-mEGFP-FGFR1	Unità di Ricerca in Oncologia Ginecologica, Istituto Europeo di Oncologia IRCCS, Milano, Italia		Zamai et al., 2019
Vettore di espressione pN1-N-Gly-mEGFP-GPI	Unità di Microscopia e Imaging Dinamico, CNIC, Madrid, Spagna		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI Vettore di espressione	Unità di Microscopia e Imaging Dinamico, CNIC, Madrid, Spagna		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., Londra, Regno Unito		Soluzione di ligando: 20 ng/mL di FGF2 in PBS integrati con 0,01% BSA.
Piruvato di sodio GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1 mM di integratore per il reagente di
trasfezione TransIt-LT1	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25200056
Tipo F Liquido da immersione 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germania	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0,1% integratore per terreno senza rosso fenolo utilizzato per le trasfezioni

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