ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

Summary

אנו מתארים את גישת ההדמיה לקביעת המצב oligomeric הממוצע של megfp-מתויג-קולטן מתויגים oligomeric הנגרמת על ידי ליגנד קשירה ממברנה פלזמה של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N & B).

Abstract

למרות החשיבות והייתה של הקולטן, שיטות מעטות ישימות לגילוי אירועים באשכולות ומדידת מידת הקיבוץ. כאן, אנו מתארים גישה להדמיה כדי לקבוע את המצב oligomeric הממוצע של mEGFP-מתויג-קולטן הומוקומפלקסי בקרום של תאים חיים. הפרוטוקול מבוסס על סך הכל מיקרוסקופ של השתקפות פנימית (TIRF) בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות (N & B). N & B היא שיטה דומה ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (FCS) והיסטוגרמה ספירת פוטון (PCH), אשר מבוססים על ניתוח סטטיסטי של תנודות של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של fluorophores מפזרת פנימה והחוצה של תאורה אמצעי אחסון במהלך זמן התבוננות. בפרט, N & B הוא פישוט של PCH כדי להשיג מידע על המספר הממוצע של חלבונים בתערובות oligomeric. תנודות אינטנסיביות המוני מתוארים על ידי בהירות מולקולרית של fluorophore ואת המספר הממוצע של fluorophores בתוך עוצמת התאורה. כך, N & B רואה רק את הרגעים הראשונים והשני של התפלגות משרעת, כלומר, את העוצמה הממוצע ואת השונות. זה, באותו זמן, את הכוח והחולשה של השיטה. כי רק שני רגעים נחשבים, N & B לא יכול לקבוע את החלק הטוחנת של oligomers לא ידוע בתערובת, אבל זה רק מעריך את מצב oligomeriטיזציה הממוצע של התערובת. עם זאת, זה יכול להיות מיושם על סדרת זמן קטן יחסית (לעומת שיטות רגע אחר) של תמונות של תאים חיים על בסיס פיקסל על ידי פיקסל, פשוט על ידי ניטור תנודות הזמן של עוצמת הקרינה. זה מפחית את הזמן האפקטיבי לפיקסל לכמה מיקרו שניות, המאפשר רכישה בטווח הזמן של שניות לאלפיות השניה, אשר הכרחי עבור הקינטיקה מהירה של oligomerization. לבסוף, שטחי תאים גדולים כמו גם תאים תת סלולריים ניתן לחקור.

Introduction

אנו מתארים כולל השתקפות פנימית מספר ובהירות (TIRF-N & B) גישה להדמיה לקביעת מצב oligomeric הממוצע של מולקולות הקולטן בקרום פלזמה של תאים חיים, מכוון בקישור הרכבה הקולטן דינמיקה לתפקוד הביולוגי של החלבונים (איור 1).

עם ליגתאי ומחייב, קולטנים ליזום את האות תאיים התמרה האותות בהתאם הקונפורמציה שלהם, oligomerization, שיתוף הפוטנציאלי קולטנים והרכב קרום. למרות החשיבות והייתה של קולטן oligomerization, מוכר כאירוע מפתח באיתות סלולרי^{1,2,3,4,5,6, 7}, כמה שיטות יכול לזהות אירועים באשכולות ולמדוד את מידת הניסויים באשכולות^8,9. כרך קונפוקלית וקד (x, y ≈ 300 ננומטר, z ≈ 900 nm) הוא פתר מספיק להוכחת אינטראקציה מולקולרית וסטויכמטריה, גם לאחר אופטימיזציה על ידי אלגוריתמים שיקום התמונה¹⁰. הרכב התת-יחידתי של חלבון oligomers אינו ניתן לפענוח על בסיס מרחבי גרידא גם על ידי שיטות ברזולוציה גבוהה ב-x, y ברזולוציה של 20-70 ננומטר כגון PALM¹¹, סטורם¹², ו ההיסטד¹³. יתר על כן, הרזולוציה הטמפורלית שלהם (בסדר של דקות לכל תמונה) לא יכול לעקוב אחר הקינטיקה בטווח של שניות. מולקולה בודדת צעד הלבנת פותרת את סטויכיומטריה של oligomers חלבון רק אם הם משותק¹⁴.

אחת השיטות הרב-תכליתיות ביותר כדי למדוד צפיפות ו oligomerization של חלבונים מתויגים פלואורוסקופים בתוך תמונות בודדות היא התפלגות בעוצמה מרחבית ניתוח (SpIDA), אשר נשענת על דגימה מרחבית. הוא חל על תאים כימיים קבועים ולחיות, ומאפשר ניתוח של מספר אזורים של העניין של התא בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ קרינה רגילה¹⁵. לחילופין, שיטות רגע, כגון ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית (fcs)¹⁶, היסטוגרמה לספירת פוטון (PCH)¹⁷, ומספר ובהירות (N & B)^18,19, מתאימים לאולייומר כמותית דידות. שיטות אלה לנתח תנודות בעוצמה פלואורסצנטית כי ניתן להבחין בזמן כאשר fluorophores לפזר והחוצה של נפח התאורה. המוני התנודות באינטנסיביות ניתן לתאר באופן ייחודי על-ידי הבהירות המולקולרית של הזוהר (ε) והמספר הממוצע של fluorophores (n) בתוך כרך התאורה¹⁷ (איור 2). בדרך כלל, מקדם דיפוזיה של fluorophores ואת המספר הממוצע של מולקולות (הקשורים באופן הפוך לערך G (0) בתוך עוצמת התאורה ניתן להשיג על ידי FCS²⁰. עם זאת, מאז זמן הדיפוזיה רק עם השורש העוקב של המסה, FCS אינו רגיש מספיק כדי לזהות שינויים במסה מולקולרית²¹. בפועל, לצבע אחד FCS אין אפשרות לזהות הדיסמזציה של קולטני הממברנה. PCH פותר תערובות של oligomers שונים במדויק. באמצעות יותר משני רגעים של התפלגות משרעת, הוא מזהה מולקולות של בהירות שונה התופסים את אותו נפח תאורה. סריקת FCS²² ופיתוחים, כגון מתאם זוג מעניין של בהירות מולקולרית (pcomb) גישה²³, הציג כדי להאריך את מגוון הישימות של שיטות מתאם פלואורסצנטית במערכות ביולוגיות²⁴ , השארו שיטות חד שונות חסרות יכולת של מדידות מהירות בשטח גדול של תא, הדורשות תצפיות רצופות רבות בכל פיקסל ורכישת נתונים בסדר השניות.

N & B הוא גרסה פשוטה של PCH הרואה רק את הרגעים הראשונים והשני של משרעת התפלגות הזריחה, כלומר את העוצמה ממוצע, , ואת השונות, σ² (איור 2)^18,19 ובגלל זה, זה לא יכול לקבוע את החלק הטוחנת של oligomers לא ידוע בתערובת, אבל רק מעריך את המצב הממוצע oligomeriטיזציה של התערובת. עם זאת, N & B יש את היתרון של עבודה עם סדרת זמן קטן יחסית של תמונות של תאים חיים מאשר PCH על בסיס פיקסל על ידי פיקסל, פשוט על ידי ניטור תנודות בזמן של עוצמת הקרינה. כיוון ש-N & B מפחית את הזמן בפיקסל למספר מיקרו-שניות, הוא יכול לעקוב אחר מהירות הקינטיקה המנותרת באזורי תאים גדולים, ולאפשר רכישת תמונה בסרגל זמן של שניות במיקרוסקופ סריקת רסטר (למשל, confocal וקד, 2-פוטון) ואלפיות השניה במיקרוסקופיה המבוססת על מצלמה (למשל, TIRFM).

מספר דוחות הפגינו את היכולת של N & B כדי לכמת את מספר יחידות המשנה באשכולות חלבונים על-ידי הדמיה של אזורי תאים מורחבים. אשכולות פעבלין-EGFP זוהו באתרי הדבקה ב-CHO-K1 תאים²⁵, והצבירה התאיים של הפפטיד Httex1p הפתוגניים תוארה ב-COS-7 תאים²⁶. N & B הוחל לאחר oligomerization מונחה ליגאן של הקולטן ErbB²⁷, ואת ההשפעה של ליגFGF21 על קלותוב (klb) ו FGFR1c בתאי הלה²⁸. השילוב של הדמיה TIRF ו-N & B ניתוח שימש כדי להראות כי דינמיות ב-2 היא בעיקר tetrameric לאורך כל קרום התא²⁹. החלתי N & B לשני סריקת רסטר ותמונות tirf להוכיח dimerization מונחה ליגור של upar ו FGFR1 תא קולטנים קרום^30,31.

שיטות מתאם פלואורסצנטית, כגון N & B, FCS ו-PCH, מבוססות על הרעיון שבנפח פתוח מספר הכיבוש של החלקיקים עוקב אחר התפלגות פואסון. כי רק את הפוטונים כי פולטות fluorophores ניתן להבחין, ערך ממוצע של עוצמת הזריחה נמדד לעומת הזמן בפיקסל של התמונה ,, הוא התוצר של המספר הממוצע של fluorophores נפח התאורה, n, ואת ה בהירות מולקולרית, ε¹⁷:

כאשר ε מבוטא כמספר הפוטונים הנפלטים ליחידת זמן (מקובל לשניה) לכל מולקולה כאשר המולקולה נמצאת במרכז עוצמת התאורה.

בהירות היא תכונה של כל fluorophore ברכישה נתונה להגדיר, בעוד האינטנסיביות הוא הסכום של כל התרומות מכל fluorophores. בתחרויות ביולוגיות, הבהירות יגדל עם הגידול של מספר fluorophores המתאחד יחד, נותן מידע על המצב oligomerization של חלבון fluoresc, מתויג. מגביר תנודות בפיקסל נתון נמדד מן השונות של האות הפלואורסצנטית, σ²:

כאשר המשמעות של ריבוע העוצמה , והריבוע של העוצמה , מחושבים מערכי העוצמה האינדיווידואליים בכל פיקסל בכל מסגרת:

כאשר K הוא מספר המסגרות הכוללות בסידרת הזמן. ניסויים, יש צורך לחשב עבור סדרת התמונות כולה את השונות המתארת את פיזור ערכי העוצמה הבודדת בכל פיקסל של תמונה אחת סביב ערך העוצמה הממוצע. השונות כוללת את כל התנודות במקורות שונים. בקירוב ראשון, השונות הנובעת מהחלקיקים הניתנים לפיזור בעוצמת התאורה, σ²₀, יכולה להיות מופרדת מן השונות עקב רעש שוט הגלאי, σ²_ד. שני השונויות הן עצמאיות; לפיכך, השונות הכוללת ניתנת על-ידי הסכום שלהם:

השונות, עקב תנודות מולקולריות של עוצמת האיתור והיציאה, תלויה בצורה לינארית בבהירות ובעוצמה המולקולרית:

מסידור מחודש של eq 6 לפי eq .1:

על פי המושג האופייני ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית, משוואה 7 קובעת כי השונות בשל מספר התנודות תלויה בריבוע של בהירות החלקיקים.

לאחר מכן, השונות עקב תנודות גלאי היא פונקציה קווית של העוצמה שזוהתה, תחת ההנחה כי הגלאי מופעל מתחת למגבלת הרוויה שלה¹⁹:

במקרה של גלאים של ספירת פוטון a= 1 ו- c= 0, ולכן שונות הגלאי שווה לעוצמה הממוצעת:

כדי להחיל מושגים אלה על מדידות אמיתיות בתאים חיים, Gratton ועמיתים¹⁸ להגדיר את הבהירות לכאורה, B, עבור כל פיקסל כיחס של שונות על העוצמה הממוצעת:

B הוא הפרמטר הנמדד באמצעות הניסויים. בעבודה זו, סדרת הזמן תמונות של קולטני FGFR1 בקרום פלזמה של תאי הלה נלכדים על ידי מיקרוסקופ TIRF ואת הבהירות לכאורה הממוצעת, B, נקבעת על ידי ניתוח N & B. לאחר מכן, לאחר הוספת FGF2, סדרת הזמן ברציפות נלכדים לבצע את השינויים העצמית הרכבה של מולקולות הקולטן במשטח הקרום לאחר גירוי של הקולטן עם ligand קאנוני.

עם זאת, מאז גלאי המיקרוסקופ TIRF הוא מצלמה EMCCD, הביטוי לבהירות לכאורה צריך להיות שונה¹⁹:

כאשר היסט הוא היסט האינטנסיביות של האלקטרוניקה לאיתור שהוא מאפיין של הגדרות הגלאי. השונות והעוצמה הממוצעת עבור גלאי אנלוגי ניתנות בהתאמה על-ידי:

כאשר G הוא רווח אנלוגי ברמות דיגיטליות (DL/פוטונים), S, הרמות הדיגיטליות לכל פוטון¹⁹, ניתנת על ידי השיפוע של עוצמה לעומת מזימה שונות עבור מקור אור עם עוצמה מתמדת (אין תנודות בזמן). הפקטור הγ קשור לצורה של אמצעי האחסון לזיהוי פיקסלים. לדברי האסלר ואח ‘³², הפקטור γ שווה 0.3 עבור הדמיה tirf עבודה ברווח המקסימלי של מצלמת האיתור¹⁹. היסט, S ו-G פרמטרים הם מאפיינים של המצלמה ואת המיקרוסקופ. הבהירות לכאורה, B, מתקבלת על ידי סידור משנה של eq. 11 לפי eq .12 ו -13:

ניסויים, ε היא פונקציה מורכבת של עוצמת לייזר ויעילות הזיהוי של המערכת. עם זאת, מאחר ש-B/S תלוי באופן ליניארי ב ε, חשוב רק לקבוע את הערך היחסי של ε עבור מצב זיהוי נתון:

כאשר ε ‘ הוא פרופורציונלי לε. עדיין, כיול מבוצע באמצעות הפניה פנימית.

Protocol

1. הכנה לדוגמא . היום הראשון זרעים הלה התאים בינוני מלא בריכוז של 100,000-200000 cell/mL במנות התחתון זכוכית. . זרע 6-8 משכפל מנותהערה: בדוגמה זו, המדיום הוא שיושלם עם 10% חום בלתי מופעל סרום שור העוברי (FBS), 1 mM נתרן פירובט, 100 U/100 μg פניצילין/סטרפטומיצין. מספר מנות שכפול מוכנות. . היום 2-3 ?…

Representative Results

התוצאות עבור שני תאים מייצגים הלה-mEGFP-FGFR1 שנזרע באותה צלחת תרבות מוצגים באיור 5 ו טבלה משלימה 1. שני התאים נלכדו בזמן 0 דקות (איור 5א, למעלה) ו -7 דקות (איור 5א, למטה) לאחר הוספת FGF2 ligand. <p class="jove_content" fo:ke…

Discussion

N & B דורש מספר אמצעי זהירות בבחירת דגם התא ואסטרטגיית התוויות. ניתן להחיל אותו רק על תאים חיים שנשארים ללא הפסק בזמן לכידת התמונה. תנודות נוספות בשל העקירה הנוקשה של התא כולו עשוי להיות מטופל עם גישות שחזור התמונה המתאים³⁸. עם זאת, בדרך כלל כאשר התא זז, קרום התא גם deforms, ואת מבנה דפ…

Materials

3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100×1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections