Lab-on-a-CD-platform til generering af flercellede tredimensionelle Sfæroider
Summary
Vi præsenterer en motordrevet centrifugal mikrofluidic enhed, der kan dyrke celle sfæroider. Ved hjælp af denne enhed, sfæroider af enkelt eller flere celletyper kunne let cocultureres under høj tyngdekraft betingelser.
Abstract
En tredimensionel sfærisk cellekultur kan opnå mere brugbare resultater i celle eksperimenter, fordi det bedre kan simulere celle mikromiljøer i den levende krop end to-dimensionelle cellekultur. I denne undersøgelse, vi fabrikerede en elektrisk motordrevet Lab-on-a-CD (Compact Disc) platform, kaldet en centrifugal microfluidic-baseret sfæroide (CMS) kultur system, at skabe tredimensionelle (3D) celle sfæroider gennemføre høj centrifugalkraft. Denne enhed kan variere rotationshastigheder til at generere tyngdekraften betingelser fra 1 x g til 521 x g. CMS-systemet er 6 cm i diameter, har 500 μm mikrobrønde, og er lavet ved støbning med Polydimethylsiloxan i en polycarbonat skimmel premade af en computer numerisk kontrol maskine. En barriere væg ved kanal indgangen til CMS-systemet bruger centrifugalkraft til at sprede cellerne jævnt inde i chippen. I slutningen af kanalen er der et diasområde, der gør det muligt for cellerne at komme ind i mikrobrøndene. Som en demonstration, sfæroider blev genereret af monokultur og coculture af menneskelige Adipose-afledte stamceller og menneskelige lunge fibroblaster under høj tyngdekraften betingelser ved hjælp af systemet. CMS-systemet brugte en simpel operation ordning til at producere coculture sfæroider af forskellige strukturer af koncentrisk, Janus og sandwich. CMS-systemet vil være nyttigt i cellebiologi og vævsteknik undersøgelser, der kræver sfæroider og organoid kultur af enkelt eller flere celletyper.
Introduction
Det er lettere at simulere biologiske in vivo-mikromiljøer med tredimensionel (3D) sfærisk cellekultur end med todimensionel (2D) cellekultur (f. eks. konventionel Petri skål cellekultur) for at producere mere fysiologisk realistiske eksperimentelle resultater1. I øjeblikket tilgængelige sfæroide formation metoder omfatter hængende dråbe teknik2, væske-overlay teknik3, natriumcarboxymethylcellulose cellulose teknik4, magnetisk kraft-baseret mikrofluidisk teknik5, og brugen af bioreaktorer6. Selv om hver metode har sine egne fordele, yderligere forbedring i reproducerbarhed, produktivitet, og generere coculture sfæroider er nødvendig. For eksempel, mens den magnetiske kraft-baserede mikrofluidisk teknik5 er relativt billig, skal virkningerne af stærke magnetiske felter på levende celler nøje overvejes. Fordelene ved sfæriske kultur, især i studiet af mesenchymal stamcelle differentiering og spredning, er blevet rapporteret i flere undersøgelser7,8,9.
Den centrifugal mikrofluidic system, også kendt som Lab-on-a-CD (Compact Disc), er nyttig til let at styre væsken inde og udnytte rotation af substratet og er således blevet udnyttet i biomedicinske applikationer såsom immunassays10, kolorimetriske assays til påvisning af biokemiske markører11, nukleinsyre amplifikation (PCR) assays, automatiserede blod analysesystemer12, og alt-i-en centrifugal mikrofluidic enheder13. Den drivende kraft, der styrer væsken er den centripetale kraft skabt af rotation. Derudover kan flere funktioner i blanding, valving og prøve opdeling gøres simpelthen i denne enkelt CD-platform. Men i forhold til ovennævnte biokemiske analysemetoder, har der været færre forsøg med at anvende CD-platforme til kultur celler, især sfæroider14.
I denne undersøgelse viser vi ydeevnen af det centrifugal mikrofluidic-baserede sfæroide (CMS) system ved monokultur eller coculture af humane Adipose afledte stamceller (HASC) og humane lunge fibroblaster (MRC-5). Dette dokument beskriver i detaljer vores gruppes Forskningsmetode15. Således kan sfæroide Culture Lab-on-a-CD-platformen let gengives. Et CMS-produktionssystem bestående af en CMS-kultur chip, en chip holder, en jævnstrømsmotor, en motormontering og en roterende platform præsenteres. Motor holderen er 3D-printet med acrylonitrilbutadien styren (ABS). Chip holderen og den roterende platform er CNC (computer numerisk styring) bearbejdet med pc’en (polycarbonat). Motorens rotationshastighed styres fra 200 til 4.500 rpm ved at indkode en PID (proportional-Integral-afledt) algoritme baseret på puls-bredde modulation. Dens dimensioner er 100 mm x 100 mm x 150 mm og den vejer 860 g, hvilket gør den nem at håndtere. Ved hjælp af CMS-systemet, kan sfæroider genereres under forskellige tyngdekraften betingelser fra 1 x g til 521 x g, så studiet af Celledifferentiering fremme under høj tyngdekraft kan forlænges fra 2D-celler16,17 til 3D sfæroide. Coculture af forskellige typer af celler er også en vigtig teknologi til effektivt at efterligne in vivo miljø18. CMS-systemet kan nemt generere monokultur sfæroider, samt coculture sfæroider af forskellige struktur typer (f. eks koncentrisk, Janus, og sandwich). CMS-systemet kan udnyttes ikke kun i simple sfæroide undersøgelser, men også i 3D organoid undersøgelser, at overveje menneskelige organ strukturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
CMS er et lukket system, hvor alle injicerede celler ind i mikrobrønden uden affald, hvilket gør det mere effektivt og økonomisk end konventionelle strips med mikrobrønde-baserede sfæroide generation metoder. I CMS-systemet udskiftes medierne hver 12 – 24 timer gennem et sugehul, der er designet til at fjerne mediet i chippen (figur 3a). Under medierne suge proces, næppe nogen medier undslipper inde i mikrobrønden på grund af overfladen spændinger mellem medierne og væggen af str…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af den grundlæggende videnskab forskning program (2016R1D1A1B03934418) og bio & medicinsk teknologiudvikling program (2018M3A9H1023141) af NRF, og finansieret af den koreanske regering, MSIT.
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
Riferimenti
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Ricerca sul cancro. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -. S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
