मल्टीकोशियलर त्रि-आयामी स्फेरॉइड पैदा करने के लिए लैब-ऑन-ए-सीडी प्लेटफॉर्म
Summary
हम एक मोटर संचालित अपकेंद्रित्र माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस पेश करते हैं जो सेल स्फेरॉइड की खेती कर सकता है। इस डिवाइस का उपयोग करके, एकल या कई सेल प्रकारों के स्फेरॉइड को उच्च गुरुत्वाकर्षण स्थितियों के तहत आसानी से सहसंस्कारित किया जा सकता है।
Abstract
एक त्रि-आयामी स्फेरॉइड सेल संस्कृति सेल प्रयोगों में अधिक उपयोगी परिणाम प्राप्त कर सकती है क्योंकि यह दो-आयामी कोशिका संस्कृति की तुलना में जीवित शरीर के सेल माइक्रोवातावरण को बेहतर ढंग से अनुकरण कर सकती है। इस अध्ययन में, हमने एक इलेक्ट्रिकल मोटर-ड्रिवेन लैब-ऑन-ए-सीडी (कॉम्पैक्ट डिस्क) प्लेटफॉर्म बनाया, जिसे एक अपकेंद्रित्र माइक्रोफ्लूइडिक आधारित स्फेरॉइड (सीएमएस) संस्कृति प्रणाली कहा जाता है, जो उच्च अपकेंद्रित्र बल को लागू करने वाले त्रि-आयामी (3डी) सेल स्फेरॉइड बनाने के लिए है। यह डिवाइस 1 x g से 521 x ग्रामतक गुरुत्वाकर्षण स्थितियों को उत्पन्न करने के लिए रोटेशन गति भिन्न हो सकती है। सीएमएस प्रणाली व्यास में 6 सेमी है, एक सौ 400 माइक्रोवेल्स है, और एक कंप्यूटर संख्यात्मक नियंत्रण मशीन द्वारा प्रीमेड पॉलीकार्बोनेट मोल्ड में पॉलीडिमिथाइलसिलिक्सान के साथ मोल्डिंग द्वारा बनाया जाता है। सीएमएस प्रणाली के चैनल प्रवेश द्वार पर एक बाधा दीवार चिप के अंदर समान रूप से कोशिकाओं को फैलाने के लिए अपकेंद्रित्र बल का उपयोग करता है । चैनल के अंत में, एक स्लाइड क्षेत्र है जो कोशिकाओं को माइक्रोवेल्स में प्रवेश करने की अनुमति देता है। एक प्रदर्शन के रूप में, स्फेरॉइड प्रणाली का उपयोग करके उच्च गुरुत्वाकर्षण स्थितियों के तहत मानव एडीपोव-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं और मानव फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट की मोनोकल्चर और सहसंस्कृति द्वारा उत्पन्न किए गए थे। सीएमएस प्रणाली ने गाढ़ा, जानस और सैंडविच की विभिन्न संरचनाओं के सहसंस्कृति स्फेरॉइड का उत्पादन करने के लिए एक सरल ऑपरेशन योजना का उपयोग किया। सीएमएस प्रणाली सेल जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग अध्ययन में उपयोगी होगी जिसमें एकल या कई सेल प्रकारों की स्फेरॉइड और ऑर्गेनॉइड संस्कृति की आवश्यकता होती है।
Introduction
दो आयामी (2डी) सेल संस्कृति (जैसे, पारंपरिक पेट्री डिश सेल संस्कृति) के साथ त्रि-आयामी (3 डी) स्फेरॉइड सेल संस्कृति के साथ वीवो माइक्रोवातावरण में जैविक अनुकरण करना आसान है ताकि अधिक शारीरिक यथार्थवादी प्रयोगात्मक उत्पादन किया जा सके परिणाम1. वर्तमान में उपलब्ध स्फेरॉइड गठन विधियों में हैंगिंग ड्रॉप तकनीक2,तरल ओवरले तकनीक3,कार्बोक्सिमेथिल सेल्यूलोज तकनीक4,चुंबकीय बल आधारित माइक्रोफ्लूइडिक तकनीक5,और उपयोग शामिल हैं बायोरिएक्टर6. यद्यपि प्रत्येक विधि के अपने लाभ हैं, प्रजनन क्षमता, उत्पादकता और सहसंस्कृति स्फेरॉइड पैदा करने में और सुधार आवश्यक है। उदाहरण के लिए, जबकि चुंबकीय बल आधारित माइक्रोफ्लूइडिक तकनीक5 अपेक्षाकृत सस्ती है, जीवित कोशिकाओं पर मजबूत चुंबकीय क्षेत्रों के प्रभाव ों पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। विशेष रूप से मेसेनचिमल स्टेम सेल भेदभाव और प्रसार के अध्ययन में स्फेरॉइड संस्कृति केलाभोंकी जानकारी कई अध्ययनों7,8,9में दी गई है ।
अपकेंद्रित्र माइक्रोफ्लूइडिक प्रणाली, जिसे लैब-ऑन-ए-सीडी (कॉम्पैक्ट डिस्क) के रूप में भी जाना जाता है, आसानी से तरल पदार्थ को अंदर नियंत्रित करने और सब्सट्रेट के रोटेशन का शोषण करने के लिए उपयोगी है और इस प्रकार इम्यूनोअस10जैसे जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों में उपयोग किया गया है, बायोकेमिकल मार्कर11,न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन (पीसीआर) परख, स्वचालित रक्त विश्लेषण प्रणाली12,और सभी में एक अपकेंद्रित्र माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों13का पता लगाने के लिए रंगीन परख । द्रव को नियंत्रित करने वाला प्रेरक बल रोटेशन द्वारा बनाया गया सेंटीपेटल बल है। इसके अतिरिक्त, मिश्रण, वाल्विंग और नमूना बंटवारे के कई कार्य इस एकल सीडी मंच में बस किए जा सकते हैं। हालांकि, उपर्युक्त जैव रासायनिक विश्लेषण विधियों की तुलना में, संस्कृति कोशिकाओं, विशेष रूप से स्फेरॉइड14पर सीडी प्लेटफार्मों को लागू करने वाले कम परीक्षण हुए हैं।
इस अध्ययन में, हम मानव एडीपोव-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एचएससी) और मानव फेफड़े के फाइब्रोब्लास्ट (एमआरसी-5) की मोनोकल्चर या सहसंस्कृति द्वारा अपेंडिफ्यूगल माइक्रोफ्लूइडिक आधारित स्फेरॉइड (सीएमएस) प्रणाली के प्रदर्शन को दिखाते हैं। यह पत्र विस्तार से हमारे समूह की अनुसंधान पद्धति15का वर्णन करता है । इस प्रकार, स्फेरॉइड कल्चर लैब-ऑन-ए-सीडी प्लेटफॉर्म को आसानी से पुन: पेश किया जा सकता है। एक सीएमएस जनरेटिंग प्रणाली जिसमें एक सीएमएस संस्कृति चिप, एक चिप धारक, एक डीसी मोटर, एक मोटर माउंट, और एक घूर्णन मंच शामिल है, प्रस्तुत किया जाता है । मोटर माउंट acrylonitrile butadiene styrene (ABS) के साथ मुद्रित 3 डी है । चिप धारक और घूर्णन मंच सीएनसी (कंप्यूटर न्यूमेरिकल कंट्रोल) पीसी (पॉलीकार्बोनेट) के साथ मशीनी हैं। पल्स-चौड़ाई मॉड्यूलेशन के आधार पर पीआईडी (आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न) एल्गोरिदम को एन्कोडिंग करके मोटर की घूर्णन गति को 200 से 4,500 आरपीएम तक नियंत्रित किया जाता है। इसके आयाम 100 मिमी x 100 मिमी x 150 मिमी हैं और इसका वजन 860 ग्राम है, जिससे इसे संभालना आसान हो जाता है। सीएमएस प्रणाली का उपयोग करके, स्फेरॉइड विभिन्न गुरुत्वाकर्षण स्थितियों के तहत 1 x g से 521 x ग्रामतक उत्पन्न किए जा सकते हैं, इसलिए उच्च गुरुत्वाकर्षण के तहत सेल भेदभाव संवर्धन का अध्ययन 2डी कोशिकाओं16,17 से 3 डी तक बढ़ाया जा सकता है स्फेरॉइड। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का सहसंस्कृति भी वीवो पर्यावरण18में प्रभावी ढंग से नकल करने के लिए एक प्रमुख तकनीक है । सीएमएस प्रणाली आसानी से मोनोकल्चर स्फेरॉइड, साथ ही विभिन्न संरचना प्रकारों (जैसे, गाढ़ा, जानस और सैंडविच) के सहसंस्कृति स्फेरॉइड उत्पन्न कर सकती है। सीएमएस प्रणाली का उपयोग मानव अंग संरचनाओं पर विचार करने के लिए न केवल सरल स्फेरॉइड अध्ययनों में बल्कि 3डी ऑर्गेनॉइड अध्ययनों में भी किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएमएस एक बंद प्रणाली है जिसमें सभी इंजेक्शन कोशिकाओं कचरे के बिना माइक्रोवेल में प्रवेश, यह पारंपरिक माइक्रोवेल आधारित स्फेरॉइड उत्पादन तरीकों की तुलना में अधिक कुशल और किफायती बना रही है । सीएमएस ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को एनआरएफ के बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम (2016आर1D1A1B03934418) और बायो एंड मेडिकल टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट प्रोग्राम (2018M3A9H1023141) द्वारा समर्थित किया गया था, और कोरियाई सरकार, एमएसआईटी द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
Riferimenti
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Ricerca sul cancro. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -. S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
