우리는 세포 효능의 주입 연구를 위한 충분한 수에 있는 관심 있는 유전자의 우수한 공동 발현을 가진 세포를 산출하는 rhesus macaque 말초 혈액 단핵 세포의 transduction 그리고 확장을 위한 9 일 프로토콜을 개략적으로 설명합니다.
전염병과 암을 취급하는 신흥 면역 요법은 수시로 질병 표적으로 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 가진 세포 인구의 transduction를 관련시킵니다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포는 암 및 바이러스 감염을 치료하는 데 CAR 분자를 코딩하는 합성 유전자를 가진 T 세포의 형질전환을 수반한다. CAR 분자는 T 세포가 특히 암 또는 바이러스성 감염한 세포를 인식하고 죽이게 합니다. 세포는 또한 관심있는 그밖 유전자와 공동 변환될 수 있습니다. 예를 들면, 세포는 특정 위치에 세포를 표적으로 하는 단백질을 코딩하는 유전자와 공동 변환될 수 있습니다. 여기서, 우리는 바이러스 특이적 CAR 및 B 세포 여포 호밍 분자 케모카인 수용체 유형 5(CXCR5)를 코딩하는 유전자로 1차 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 트랜스듀싱하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 9 일이 걸리고 중앙 기억 표현형을 유지하는 변환된 T 세포 집단에서 유래합니다. 중앙 기억 또는 덜 분화 된 표현형의 유지 보수는 주입 후 세포의 지속성과 관련이 있는 것으로 나타났다. 더욱이, 이 방법으로 생성된 세포는 높은 수준의 생존율, 두 개의 형질전환된 유전자의 공동 발현의 높은 수준, 면역 치료 주입을 위한 충분한 양의 세포를 보여준다. 이 9일 프로토콜은 CAR-T 세포 및 다른 T 세포 면역 요법 접근법에 광범위하게 사용될 수 있다. 여기에 설명된 방법은 이전 간행물에 제시된 연구를 기반으로 합니다.
세포 면역 요법은 암과 전염병을 포함한 질병을 치료하는 새로운 수단으로 부상하고 있습니다. 이 면역 요법 방법은 수시로 특정 분자를 표현하기 위하여 치료 세포를 유전으로 조작하는 관련시킵니다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 병에 걸린 세포에 분자를 특이하게 결합하는 세포외 도메인과 병들한 세포를 죽이는 면역 세포를 유발하는 신호 도메인을 가지는 CAR 분자를 발현하도록 설계되었습니다. CAR T 세포는 암 면역요법에 성공적으로 사용되고 있으며, B 세포 백혈병 치료에 특히 효과적이다1,,2,,3. CAR-T 세포는 또한 HIV와 같은 바이러스성 감염을 취급하기 위하여 개발되고 있습니다. HIV 특이적 CA는 바이러스성 감염된 세포의 표면에 봉투 단백질을 표적으로4. 면역 치료 세포는 또한 특정 조직 위치에 치료 세포를 표적으로 하는 호밍 분자를 발현하도록 설계될 수 있습니다. 우리는 바이러스 특이적인 CAR 뿐만 아니라 림프성 여포 homing 분자 CXCR55를변환하는 벡터를 개발했습니다.
인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 시미안 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한 일부 바이러스의 바이러스 복제는 이차 림프 조직에서 B 세포 여포 내에 집중되어6. B 세포 여포는 바이러스 특이적 CTL의 낮은 수준이 지속적인 바이러스복제를허용하는 다소 면역 특권 사이트입니다7,8. 이러한 이유로, CXCR5의 발현을 통해 모낭 내로 HIV/SIV 특이적 T 세포를 표적화하는 것은 바이러스감염세포의 여포저장소를 제거하기 위한전략이다 9,,10. 구체적으로, 우리는 CXCR5 공동 발현을 통해 B 세포 여포에 SIV 특이적 CAR T 세포를 표적으로 하고 있다.
이 프로토콜에서 우리는 CAR/CXCR5를 변환하고 치료 주입을 위한 충분한 양의 CAR/CXCR5 T 세포를 생성하기 위하여 PBMC를 확장하는 방법을 기술합니다. 이러한 방법으로 형질전환된 세포는 중앙 메모리 표현형을 유지한다. 연구에 따르면 중앙 기억 T 세포및 T기억줄기세포와 같이 분화된 표현형이 덜분화된 세포는분화세포(11,,12)보다더 잘 지속된다. 또한, 채택적으로 전달된 세포를 생성하도록 설계된 많은 프로토콜은 상대적으로 긴 배양 시간을 가지며, 이는 보다 분화된 표현형 및 감소된 지속성을 가지는세포(13)를초래한다. 더욱이, 비장의 폐에 표적 림프조직 대신에 폐 내에 축적된 배양시간이 긴 세포를 채택적으로 옮겼다14,,15. 여기서 설명하고 설명하는 방법에서, 우리는 중앙 기억 표현형을 유지하는 트랜스듀렉트 세포를 생산하기 위해 rhesus macaque PBMC를 신속하게 변환하고 확장합니다.
CD4와 CD8 T 세포는 모두 우리의 면역 요법 접근법에 포함되어 있습니다. 이러한 혼합 세포 집단은 임상 시험에서 CD8+ T 세포 생성물에서 CD4+ T 세포의 부재가 16을지속하기 위해 주입된 CD8 T 세포의 실패와 상관관계가 있었기 때문에 선택되었다. 여기서 설명된 방법은 T 세포 수용체를 강력하게 자극하고 클론 변성17,,18을피하기 위해 공동 자극 신호를 제공하는 항 CD3 및 항 CD28 항체로 PBMC를 활성화함으로써 시작됩니다.
활성화 후, 세포는 바이러스 특이적 CAR 및 림프구 호밍 분자 CXCR5를 인코딩하는 감마레트로바이러스 벡터로 트랜스화된다. 그런 다음 기저부에서 가스 투과성 멤브레인이 있는 비부착 세포 전파용으로 설계된 플레이트를 사용하여 트랜스듀싱 셀을 확장합니다. 이 막은 세포 생존 및 영양 가용성 향상으로 이어지는 우물의 바닥에 가스 교환을 허용19. 이러한 방법을 사용하여 생체 내 주입 연구를 위해 9 일 기간에 충분한 기능성 세포를 생성 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 rhesus macaque T 세포를 변환하고 확장하기 위해 설계되었지만 종 별 활성화 항체를 약간 수정하여 다른 종의 세포와 함께 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 이전에 발표 된 연구9,,20을기반으로합니다.
이 프로토콜은 항바이러스 CAR뿐만 아니라 여포 호밍 수용체인 CXCR5를 발현하는 T 세포 집단으로 이어지는 rhesus macaque PBMC를 변환하기 위해 감마레트로바이러스 벡터를 활용하는 T 세포 면역 요법 생산 전략을 설명합니다. 생체배양 시간의 총 8일로, 실행 가능한, 기능성 CAR T 세포는 전임상 효능 시험을 위해 비인간 영장류내로 주입하는 데 사용되는10,,21,,22 범위 내에 있는 양으로 생산된다.
전착 프로토콜의 성공은 건강하고 자극된 PBMC와 감마레트로바이러스의 품질 제제에 의존합니다. 성공적인 자극 및 전이를 달성하기 위해서는 수집 후 PBMC의 동결 및 수송에 적절한주의를 기울여야합니다. 이상적으로, 세포가 현장에서 수집되는 경우, 그들은 액체 질소로 출하되고 신속하게 장기 액체 질소 저장에 배치됩니다. 감마레트로바이러스에 의해 성공적으로 변환되려면 PBMC가 유사하게 활성화되어야 합니다. 하나는 안티 CD3 / 안티 CD28와 자극 후 세포의 클러스터링을 시각적으로 모니터링해야합니다. 제대로 활성화되지 않으면 전도 효율이 낮아집니다. 자극된 세포에서 생존 가능성을 모니터링하는 것도 중요합니다. 자극 단계 후 불쌍한 생존력은 일반적으로 덜 성공적인 형질전환으로 이어집니다. 바이러스 제제는 실험실에서 생산되든 아웃소싱이든 바이러스를 손상시키고 전도 효율을 손상시킬 수 있는 동결 해동 주기를 피하기 위해 일회용 aliquots에서 -80°C에 보관해야 합니다. 바이러스는 각 실험에서 일관된 양의 바이러스를 사용할 수 있도록 적시되어야 합니다. 전이에 바이러스를 사용할 때, 신속하게 바이러스를 해동하고 필요할 때까지 얼음에 저장. 프로모터, 인핸서 및 엔벨로프 단백질의 선택은 모두 표적 세포에서 의 형질전환 효율 및 이식유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 MOI는 경험적으로 결정되어야 합니다. 또한, 팽창을 위한 가스 투과성 웰을 가진 T 세포 및 플레이트를 지지하도록 설계된 매체의 사용은 형질전환 세포의 우수한 확장을 이끌었다. 그러나, 동물세포 팽창속도에서 동물가 변이성이 있다. 우리는 변환하고 확장하는 특정 세포 준비의 기능을 결정하기 위하여 예심 연구 결과 추천합니다. 확장 수준은 소규모 및 대규모 변환 모두에서 일관적입니다.
이 프로토콜의 사용으로, 우리는 시험 동물에 주입을 위한 2.5 x 109 세포까지 생성했습니다. 우리는 이 때 프로토콜을 확장하는 것이 불필요하다는 것을 것을을 발견했더라도, 6개의 웰 플레이트의 사용은 대규모 세포 준비에 제한이 있고 프로토콜은 더 많은 수의 세포를 생성하기 위하여 수정이 필요할 것입니다. 잠재적인 변형의 예로는 섬유넥틴 코팅 배양 백에서 형질전환을 수행하여 트랜스듀렉션된 세포의 수를 증가시키고 확장 단계에 대한 더 큰 가스 투과성 배양 용기를 활용하는 것이 포함한다. 아직 이러한 변경을 하지 는 않았지만 시판되는 제품을 활용하고 현재 프로토콜을 수정할 수 있습니다.
이 방법을 사용하여, 우리는 감염되지 않은 동물, SIV 감염 동물 및 항 레트로 바이러스 요법으로 치료된 SIV 감염 동물로부터 분리된 PBMC로부터 트랜스듀싱 된 세포를 생산했습니다(ART). 그러나, 우리는 ART 처리 된 세포(20)에서형광 효율의 감소를 지적했다. 이 감소는 아마도 약물에 의해 역 전사 체 및/또는 integrase의 억제 때문. ART 처리된 동물로부터세포의 환원은 PBMC를 수집하기 전에 또는 일반적으로 사용되는 ART 약물에 의해 영향을 받지 않는 대체 벡터의 사용을 통해 며칠 동안 ART를 중지시킴으로써 ART 약물의 세포내 수준을 감소시키는 것과 같은 이 프로토콜에 대한 수정을 요구할 것이다.
면역 요법을 위해 생산된 세포는 최소로 분화된 표현형이되어 주입 후12를지속하는 것이 중요합니다. 세포의 입양 전달을 위한 많은 프로토콜은 긴 배양 시간을 필요로 하지만, 감소된 생체 배양 시간은 CAR T 세포기능의감소 및 CAR T 세포 기능의 개선 모두와 상관관계가 있다. 이러한 감전 및 확장 프로토콜의 비교적 빠른 기간은 그들의 면역 치료 전위20의시험을 위한 충분한 세포를 여전히 생성하면서 원하는 중앙 기억 표현형의 유지를 허용한다.
이 T 세포 면역 요법 제품에 대한 생산 전략의 목표는 SIV 감염 세포를 인식하는 T 세포를 제조하는 것이며, B 세포 여포에서 바이러스 복제 부위로 트래픽을 유도하고 장기적으로 동물에서 지속될 것입니다. 항 레트로 바이러스 약물없이 기능성 치료. 인간 면역 요법 제품으로의 번역을 위해, 이 프로토콜은 인간 특이적 항체 및 사이토카인의 사용과 GMP 표준의 구현을 통해 인간 T 세포를 변환하기 위해 변형될 수 있으며, 이를 위한 기능적 치료법을 생산하는 궁극적인 목표 에이즈.
The authors have nothing to disclose.
본 연구는 NIH 보조금 5R01AI096966-06S1(PS, EC 및 EB), 1UM1AI26617(PS, EC, P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH 교부금 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A14 3380-01 (PS 및 EB), 1UM14126617 (PS 및 EC) 뿐만 아니라 교내 연구의 NIAID 부서와 NIH 교내 에이즈 표적 항 바이러스 프로그램에 의해 제공되는 자금. 이러한 연구에 사용된 항-CD3 및 항-CD28은 NIH 비인간 영장류 시약 자원(R24 OD010976, U24 AI126683)에 의해 제공되었다. 이러한 연구에서 사용되는 IL-2는 NCI 전임상 저장소에 의해 제공되었다. 이 CD4-MBL CAR/CXCR5 프로젝트의 협력자, 애리조나 대학의 엘리자베스 코닉 박사, NIH NIH의 에드워드 A 버거 박사, 위스콘신 국립 영장류 연구 센터의 에바 G 라카즈 박사, 위스콘신 국립 영장류 연구 센터의 에바 G 라카스 박사, 제프 하트 박사, 미네소타 대학의 제프 하트 박사, 미네소타 대학의 제프 하트 박사와 프레티 하란 박사, 미네소타 대학의 제프 하트 박사와 프레티 하란 박사, 애리조나 대학의 엘리자베스 코닉 박사, NIH, NIH, 박사 에바 G 라카즈 박사, 미네소타 대학의 제프 하트 박사와 프레티 하란 박사, 미네소타 대학의 하버드 대학의 제프 하트 박사와 프레티 하란 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 미네소타 대학의 스콧 맥아이버 박사, 프레드 허친슨 암 센터의 크리스토퍼 피터슨 박사, NIH의 매튜 트리벳 박사, 시애틀 아동 병원의 아그네 타라세비시우트 박사, 어린이 연구소의 콘래드 러셀 크루즈 박사에게 매우 도움이 되는 도움을 주었습니다. 또한 미네소타 대학교의 치판(Chi Phan) 씨와 조메리 알레그리아-베로칼(Jhomary Alegria-Berrocal) 씨가 감마레트로바이러스 생산을 위해, 위스콘신-매디슨 대학의 킴 바이스그라우(Kim Weisgrau) 씨가 rhesus macaque PBMC를 격리한 것에 대해 감사하게도 인정합니다.
Gammaretrovirus preparation | |||
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
T cell stimulation | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
For Fibronectin coating | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
For T cell Expansion | |||
G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
Media Components | |||
b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
Variations of Media used | |||
Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
Cell counting | |||
Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
Flow Cytometry | |||
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
Other equipment | |||
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |