Questo articolo descrive un metodo di trapianto per innestare cellule epiteliali mammarie del donatore nel cuscinetto di grasso bianco interscapular degli animali riceventi. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare gli effetti dell'ospite e/o del donatore sullo sviluppo dell'epitelio mammario ed elimina la necessità di pre-clearing, estendendo così l'utilità di questa tecnica.
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Articolo metodologico
Rat mammary Epithelial Cell Transplantation nel Pad Grasso Bianco Interscapular
In questo articolo
Sommario
Abstract
Già negli anni '70, i ricercatori hanno trapiantato con successo cellule epiteliali mammarie nel cuscinetto di grasso bianco interscapoare dei ratti. L'innesto dell'epitelio mammario con tecniche di trapianto sfrutta l'ambiente ormonale fornito dall'ospite di roditori adolescenti. Questi studi sono ideali per esplorare l'impatto di varie manipolazioni biologiche sullo sviluppo della ghiandola mammaria e sezionare molti aspetti della biologia della ghiandola mammaria. Una caratteristica comune, ma limitante, è che le cellule epiteliali trapiantate sono fortemente influenzate dallo stroma circostante e superate dall'epitelio endogeno; per utilizzare il tessuto mammario nativo, il cuscinetto di grasso bianco addominale-inguinale deve essere eliminato per rimuovere l'epitelio mammario ospite prima del trapianto. Un ostacolo importante quando si utilizza l'organismo modello di ratto è che la cancellazione dell'albero mammario in via di sviluppo nei ratti post-svezzamento non è efficiente. Quando trapiantate in cuscinetti di grasso privi di ghiandola, le cellule epiteliali del donatore possono ripopolare il cuscinetto di grasso ospite eliminato e formare una ghiandola mammaria funzionale. Il cuscinetto di grasso interscapular è una posizione alternativa per questi innesti. Un grande vantaggio è che manca di strutture frandutali ma fornisce il normale stroma che è necessario per promuovere la crescita epiteliale ed è facilmente accessibile nel ratto. Un altro grande vantaggio di questa tecnica è che è minimamente invasiva, perché elimina la necessità di cauterizzare e rimuovere l'albero di mammifero endogeno in crescita. Inoltre, il cuscinetto di grasso interscapular contiene un vaso sanguigno mediale che può essere utilizzato per separare i siti per l'innesto. Poiché le ghiandole endogene rimangono intatte, questa tecnica può essere utilizzata anche per studi che confrontano la ghiandola mammaria endogena con la ghiandola trapiantata. Questo documento descrive il metodo di trapianto di cellule epiteliali mammarie nel cuscinetto di grasso bianco interscapular di ratti.
Introduzione
Lo sviluppo della ghiandola mammaria postnatale e la morfogenesi duttale sono processi in gran parte influenzati dalla segnalazione ormonale all'inizio della pubertà. Nei topi e nei ratti, organismi modello comunemente usati della biologia della ghiandola mammaria, questo processo inizia intorno a 3 settimane di età, dove la rapida proliferazione e differenziazione provocano la formazione del parenchyma maturo. La ghiandola mammaria matura può subire numerosi cicli di espansione e involuzione, una proprietà che è stata in fase di studio fin dall'inizio del XXsecolo. Nel contesto dell'iperproliferazione e dello sviluppo del cancro, le tecniche di trapianto d....
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Protocollo
Tutti gli animali sono stati alloggiati e mantenuti in una struttura approvata dall'AAALAC, e gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati approvati dal MUSC Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC). Gli animali da utilizzare nei trapianti reciproci devono essere un ceppo inbred o isogenico, con uno status congenico preferito o arrancato per almeno 6 generazioni.
1. Donatore di ratto mammario ghiandola
- Determinare il numero di ratti donatori necessari per il trapianto.
NOTA: Generalmente, 1 ratto donatore (4 settimane di età) può fornire abbastanza cellule per il trapianto in 4 animali ricogniti. Alcune ap....
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Risultati
Donatore e trighi mammarie destinatarie
I passaggi per isolare e preparare le cellule epiteliali mammarie del ratto per il trapianto sono illustrati nella Figura 1A. A 4 settimane di età, la ghiandola mammaria endogena del ratto donatore ha iniziato la maturazione e l'epitelio può essere visualizzato su interi vetrini montati macchiati con carmine di allume (Figura 1
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Discussione
Questo protocollo descrive una tecnica di trapianto di cellule epiteliali mammarie ottimizzata per lavorare con i ratti. Gli organoidi epiteliali mammari isolati dai ratti donatori (3-5 settimane di età) vengono innestati nel cuscinetto di grasso bianco interscapular dei ratti ricitti (anche 3-5 settimane di età). I risultati possono essere interpretati appena 4-6 settimane dopo, utilizzando la microscopia leggera per esaminare il tessuto innestato; tuttavia, la quantità ottimale di tempo tra il trapianto e il sacrificio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal Cancer Center Di Hollings Cancer Center Support Grant P30 CA138313 finanziamenti pilota di ricerca dal National Institutes of Health(https://www.nih.gov/)e fondi dal Dipartimento di Patologia & Medicina di laboratorio presso la Medical University of South Carolina. Ringraziamo Marijne Smiths per aver registrato le dichiarazioni dell'intervista.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,2 µ M filtri per siringa | Fisher Scientific | 09-715G | Terreno di digestione della collagenasi a filtro sterile |
| 1,5 - 2,0 mL provette per microcentrifuga (sterili) | Fisher Scientific | 05-408-129 | contenente cellule risospese e/o miscela di omogeneizzato cerebrale |
| 100 &; Filtri per cellule M | Corning | 431752 | filtrante cervello omogeneizzato |
| Siringhe a tenuta di gas da 100 uL con aghi da 25 gauge | Hamilton | 81001 e 90525 | Per l'iniezione di una miscela di innesti in animali riceventi (1 per genotipo/condizione del donatore) |
| Puntali per pipette da 1000 uL + pipetta | - | trasferimento di cellule/miscele/tessuti | |
| Tubo in polipropilene da 15 mL | Falcon (Corning) | 352196 | Stoccaggio della miscela di omogeneizzato cerebrale, o cellula: miscela di omogeneizzato per trapianto |
| 40 Μ Filtri cellulari | M Corning | 431750 | organoidi filtranti dopo il lavaggio del pellet cellulare |
| Provette in polipropilene da 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-6 | per la digestione della collagenasi del tessuto della ghiandola mammaria del donatore |
| Piastre da 60 mm Thermo | Scientific | 130181 | per la macinazione dei tessuti |
| Allume Solfato di potassio | Sigma-Aldrich | 243361/237086 | colorazione ghiandola mammaria montatura intera diapositive Vaporizzatore |
| anestesia per uso veterinario | - | seguire il protocollo istituzionale | |
| Beta-dine o iodio | - | ||
| Tubo di coltura in vetro borosilicato per omogeneizzazione | Fisher Scientific | 14-961-26 | per omogeneizzazione del cervello (utilizzare un tubo appropriato per l'omogeneizzatore) |
| Carmine | Sigma-Aldrich | C6152/1022 | colorazione ghiandola mammaria |
| Apparecchi per il conteggio delle cellule | - | ||
| Gabbie per animali pulite per il recupero | - | seguire il protocollo istituzionale | |
| Collagenasi Tipo 3 | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | digestione enzimatica di tessuto tritato della ghiandola mammaria da ratti donatori acqua |
| deionizzata | - | per soluzioni chimiche | |
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320033 | per la macinazione di tessuti, mezzi di digestione collagenasi e miscele di cellule epiteliali risolubili |
| EDTA | - | miscela monodispersione | |
| Etanolo, 200 Proof | Decon Labs | 2705/2701 | fissativo per vetrini per montatura intera mammaria, lavaggi per vetrini per montatura intera mammaria, pulizia di siti di incisione chirurgica (diluito) |
| Siero bovino fetale (FBS) | Soluzione per inattivazione | icloni | |
| Garza | - | - | |
| Acido acetico glaciale | Fisher Scientific | A38-212 | uso per il fissativo per vetrini per montatura intera mammaria (acido acetico glaciale 1:4 in etanolo al 100%) |
| HBSS | GIBCO | - | miscela monodispersione |
| Cuscinetti riscaldanti | - | - | seguire il protocollo istituzionale |
| Secchielli per il ghiaccio (x2) | - | - | |
| Incubatrice con rotazione orbitale | - | -devono essere in grado di mantenere 37° C, agitazione a 220-225 giri/min (per la digestione della collagenasi del tessuto mammario) | |
| Anestesia con isoflurano | - | seguire il protocollo istituzionale | |
| Microscopio ottico o fotocamera digitale | - | visualizzazione dell'intero epitelio mammario montato e/o acquisizione di immagini | |
| Omogeneizzatore meccanico | Fisher | Scientific-TissueMiser | o modelli alternativi |
| Olio minerale, puro | Sigma-Aldrich/ ACROS Organics | 8042-47-5 | conservazione a lungo termine di supporti interi per ghiandola mammaria ripulita Serbatoi di |
| ossigeno per vaporizzatore per anestesia | - | seguire il protocollo istituzionale | |
| Asciugamani di carta o salviette per attività delicate | - | ||
| Vetrini per microscopio caricati positivamente | Thermo Scientific | P4981-001 | tessuto della ghiandola mammaria monta intero |
| Postoperatorio analgesico | - | - | Protocollo istituzionale |
| Misure | del peso corporeo degli animali, dosaggio corretto di farmaci antidolorifici | ||
| Rasoio | - | - | tosatrici elettriche, o altri |
| barattoli di colorazione | - | - | minimo di 1 per lavaggio chimico, dimensioni appropriate per il numero di vetrini, vetro preferito |
| Teli da campo sterili | IMCO | 4410-IMC | utilizzato durante il trapianto |
| Forbici e pinze sterili x3 (autoclavato) | - | strumenti chirurgici in autoclave utilizzati per donatori e riceventi | |
| Siringhe: 5 ml (o superiore) | - | per la filtrazione sterile dei mezzi di digestione della collagenasi | |
| Miscela monodispersione | Trypsin | Worthington | |
| Recipiente per la raccolta dei rifiuti per liquidi (versati o aspirati) | - | - | |
| Applicatore di clip per ferite, clip e strumento di rimozione | Fine Science Tools | 12020-00 | Chiusura dell'incisione cutanea sul tampone bianco interscapolare |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | che elimina la ghiandola mammaria l'intero montaggio scivola dopo la colorazione |
Riferimenti
- DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. Development of Mammary Tumors from Hyperplastic Alveolar Nodules Transplanted into Gland-free Mammary Fat Pads of Female C3H Mice. Cancer Research. 19 (5), 515-520 (1959).
- Gould, M. N., Biel, W. F., Clifton, K. H.
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Ristampe e permessi
