Stereologisk vurdering af kolinerge fiberlængde i Nucleus Basalis af Meynert af Mouse Brain
Summary
Neuronal fiber længde inden for en tre-dimensionel struktur i en hjerne region er en pålidelig parameter til at kvantificere specifikke neuronal strukturel integritet eller degeneration. Denne artikel beskriver en stereologisk kvantificeringsmetode til måling af kolinerge fiberlængde i meynerts kernebasalis i mus som et eksempel.
Abstract
Længden af kolinerge eller andre neuronal axoner i forskellige hjerneregioner er ofte korreleret med den specifikke funktion af regionen. Stereologi er en nyttig metode til at kvantificere neuronale profiler af forskellige hjernestrukturer. Her leverer vi en software-baseret stereologi protokol til at vurdere den samlede længde af kolinerge fibre i kernen basalis af Meynert (NBM) af basal forhjernen. Metoden bruger en rumkuglesonde til længdeestimater. De kolinerge fibre visualiseres ved cholin acetyltransferase (ChAT) immunfarvning med peberrod peroxidase-diaminobenzidin (HRP-DAB) detektionssystem. Farvningsprotokollen gælder også for fiber- og cellenummerestimering i forskellige hjerneområder ved hjælp af stereologisoftware. Stereologi protokollen kan bruges til estimering af eventuelle lineære profiler såsom kolinoceptive fibre, dopaminerge/catecholaminergic fibre, serotonergic fibre, astrocyt processer, eller endda vaskulære profiler.
Introduction
Kvantitative skøn over længden og/eller tætheden af nervefibre i hjernen er vigtige parametre for neuropatologiske undersøgelser. Længden af kolinerge, dopaminerge, og serotonerge axoner i forskellige hjerneregioner er ofte korreleret med de specifikke funktioner i regionen. Fordi fordelingen af disse axoner er generelt heterogen, design-baseret stereologi bruges til at undgå bias under prøveudtagning. Rumkuglesonden af stereologi er designet til at give effektive og pålidelige foranstaltninger af linjelignende strukturer såsom neuronale fibre i en region af interesse1. Sonden gør en virtuel kugle, der pålægges systematisk i vævet til at måle linje skæringspunkter med overfladen af sonden. Fordi det er umuligt at sætte sfære sonder i vævet til analyse, den kommercielt tilgængelige software giver en virtuel tre-dimensionelle (3D) kugle, som er dybest set en række koncentriske cirkler af forskellige diametre, der repræsenterer overfladen af kuglesonden.
Selektiv kolinerge neurodegeneration er en af de konsekvente træk ved Alzheimers sygdom (AD)2,3,4. Dysfunktionel kolinerge transmission betragtes som en årsagsfaktor for kognitiv tilbagegang i AD. Kolinerge dysfunktion er også tydeligt i mange andre psykiske lidelser såsom Parkinsons, afhængighed, og skizofreni. Forskellige aspekter af kolinerge neurodegeneration er undersøgt i dyremodeller (f.eks reduktion i acetylcholin5, ChAT protein6, kolinerge fiber neurodegeneration i nærheden af amyloid plaques6, og fald i kolinerge fibre og synaptic varicosities7,8). Fiber degeneration menes at finde sted tidligere end neuronal tab, fordi kolinerge neuronal tab ikke altid observeres i undersøgelser. De fleste af de kolinerge neuroner er i de basale forhjernen og hjernestammen, og deres axoner projekt til forskellige hjerneregioner såsom korticeer og hippocampus. NBM er beliggende i basal forhjernen og viser sig at være en af de almindeligt ramte hjerneområder i AD.
Den fraktioneret metode stereologi er baseret på systematisk stikprøveaf et væv på flere niveauer. Sektionsprøvefraktion (SSF) er den ikke-computerbaserede systematiske prøveudtagning af sektioner til fraktionerets tenologiske metode. Arealprøvetagningsfraktion (ASF) er fraktionering af et område i området af interesse for sektionen. Tykkelse sprøveudtagning fraktion (TSF) er fraktioneringen af tykkelsen af en sektion. Rumkuglesonden giver os mulighed for at kvantificere interesseprofiler i en 3D-kugle på fraktionerede steder. Her bruger vi en rumkuglesonde til estimering af den samlede længde af kolinerge fibre i NBM af musehjernen til at illustrere procedurerne. Den nuværende protokol indeholder oplysninger om vævsbehandling, prøvetagningsmetoder til stereologi, immunhistokemisk farvning ved hjælp af ChAT antistof, og upartisk stereologi til at vurdere kolinerge fiber længde og fibertæthed i NBM af musen shjerne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her demonstrerer vi en metode til at vurdere tætheden af kolinerge fibre i NBM ved hjælp af en rumkugle (kugle) sonde. Denne sonde anslår den samlede fiberlængde i interesseområdet. Den samlede længde kan divideres med mængden af regionen for at få fibertætheden. For at anslå regionens volumen blev Kavalieri-pointtællingsmetoden anvendt. Cavalieri point count metoden er en upartisk og effektiv estimator af en 3D-referencevolumen for enhver region. Metoden beregner et skøn over arealet på en afskåret flade a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud til W.Z.S. fra Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Alzheimers Association (NPSPAD-11-202149), og ressourcer fra Midtvesten Biomedical Forskningsfond.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
Riferimenti
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology–reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
