O comprimento da fibra neuronal dentro de uma estrutura tridimensional de uma região cerebral é um parâmetro confiável para quantificar a integridade estrutural neuronal específica ou a degeneração. Este artigo detalha um método de quantificação estereológica para medir o comprimento da fibra cholinergicdentro do núcleo basalis de Meynert em camundongos como exemplo.
O comprimento de axônons cholinergic ou outros axônticos neuronais em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com a função específica da região. A estereologia é um método útil para quantificar perfis neuronais de várias estruturas cerebrais. Aqui fornecemos um protocolo de estereorologia baseado em software para estimar o comprimento total das fibras colinérgicas no núcleo basalis de Meynert (NBM) do cérebro do forebrain basal. O método usa uma sonda de bola espacial para estimativas de comprimento. As fibras colinérgicas são visualizadas pelo sistema de detecção de acetiltransferase de colina (ChAT) com o sistema de detecção de peroxidase-diaminobenzidina (HRP-DAB). O protocolo de coloração também é válido para estimativa de fibras e números de células em várias regiões cerebrais usando software de estereologia. O protocolo de estereorologia pode ser usado para estimativa de quaisquer perfis lineares, como fibras colececeptivas, fibras dopaminérgicas/catecolaminergicas, fibras sorotonergicas, processos ascicitos ou até mesmo perfis vasculares.
Estimativas quantitativas de comprimento e/ou densidade de fibras nervosas no cérebro são parâmetros importantes de estudos neuropatológicos. O comprimento dos axônhonas cholinergicgic, dopaminergice e sorotonergicos em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com as funções específicas da região. Como a distribuição desses axôlos é geralmente heterogênea, a estereorologia baseada em design é usada para evitar viés durante a amostragem. A sonda de bola espacial da estereorologia foi projetada para fornecer medidas eficientes e confiáveis de estruturas semelhantes a linhas, como fibras neuronais em uma região de interesse1. A sonda faz uma esfera virtual que é imposta sistematicamente no tecido para medir intersecções de linha com a superfície da sonda. Por ser impossível colocar sondas de esfera no tecido para análise, o software comercialmente disponível fornece uma esfera virtual tridimensional (3D), que é basicamente uma série de círculos concêntricos de vários diâmetros que representam a superfície da sonda esfera.
A neurodegeneração colinérgica seletiva é uma das características consistentes da doença de Alzheimer (AD)2,3,4. A transmissão colinérgica disfuncional é considerada um fator causal para o declínio cognitivo em AD. A disfunção colinérgica também é evidente em muitos outros transtornos mentais, como Parkinson, vício e esquizofrenia. Diferentes aspectos da neurodegeneração cholinergicsão são estudados em modelos animais (por exemplo, redução na acetilcolina5,proteína ChAT6,neurodegeneração de fibras cholinergicas nas proximidades de placas amiloides6, e diminuição em fibras cholinergic e varicos sinápticos7,8). Acredita-se que a degeneração da fibra ocorra antes da perda neuronal, porque a perda neuronal cholinergica nem sempre é observada em estudos. A maioria dos neurônios colinérgicos estão no cérebro basal e no tronco cerebral, e seus axôlos projetam para várias regiões cerebrais, como os cortices e o hipocampo. O NBM está situado no cérebro basal e descobriu-se ser uma das áreas cerebrais comumente afetadas em D.C.
O método fracionário da estereologia baseia-se na amostragem aleatória sistemática de um tecido em múltiplos níveis. A fração amostral de seção (SSF) é a amostragem sistemática não baseada em computador de seções para o método fracionário de estereology. A fração amostral de área (ASF) é a fracionamento de uma área da região de interesse no trecho. Fração amostral de espessura (TSF) é a fracionamento da espessura de uma seção. A sonda de bola espacial nos permite quantificar perfis de interesse em uma esfera 3D em locais fracionados. Aqui usamos uma sonda de bola espacial para estimar o comprimento total das fibras cholinergic no NBM do cérebro do rato para ilustrar os procedimentos. O protocolo atual fornece detalhes sobre processamento de tecidos, métodos de amostragem para estereology, coloração imunohistoquímica usando o anticorpo ChAT e estereorologia imparcial para estimar o comprimento da fibra cholinergice e a densidade de fibras no NBM do cérebro do rato.
Aqui demonstramos um método para estimar a densidade de fibras cholinergic no NBM usando uma sonda de esfera espacial (esfera). Esta sonda estima o comprimento total da fibra na região de interesse. O comprimento total pode ser dividido pelo volume da região para obter a densidade da fibra. Para estimar o volume da região, utilizou-se o método de contagem de pontos Cavalieri. O método de contagem de pontos Cavalieri é um estimador imparcial e eficiente de um volume de referência 3D para qualquer região. O métod…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por subsídios à W.Z.S. do Serviço de Pesquisa e Desenvolvimento Médico, Departamento de Assuntos de Veteranos (Revisão de Mérito 1I01 BX001067-01A2), associação de Alzheimer (NPSPAD-11-202149) e recursos do Midwest Biomedical Fundação de Pesquisa.
ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |