Estimativa estereológica do comprimento da fibra cholinergica no Núcleo Basalis de Meynert do Cérebro do Rato

Summary

O comprimento da fibra neuronal dentro de uma estrutura tridimensional de uma região cerebral é um parâmetro confiável para quantificar a integridade estrutural neuronal específica ou a degeneração. Este artigo detalha um método de quantificação estereológica para medir o comprimento da fibra cholinergicdentro do núcleo basalis de Meynert em camundongos como exemplo.

Abstract

O comprimento de axônons cholinergic ou outros axônticos neuronais em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com a função específica da região. A estereologia é um método útil para quantificar perfis neuronais de várias estruturas cerebrais. Aqui fornecemos um protocolo de estereorologia baseado em software para estimar o comprimento total das fibras colinérgicas no núcleo basalis de Meynert (NBM) do cérebro do forebrain basal. O método usa uma sonda de bola espacial para estimativas de comprimento. As fibras colinérgicas são visualizadas pelo sistema de detecção de acetiltransferase de colina (ChAT) com o sistema de detecção de peroxidase-diaminobenzidina (HRP-DAB). O protocolo de coloração também é válido para estimativa de fibras e números de células em várias regiões cerebrais usando software de estereologia. O protocolo de estereorologia pode ser usado para estimativa de quaisquer perfis lineares, como fibras colececeptivas, fibras dopaminérgicas/catecolaminergicas, fibras sorotonergicas, processos ascicitos ou até mesmo perfis vasculares.

Introduction

Estimativas quantitativas de comprimento e/ou densidade de fibras nervosas no cérebro são parâmetros importantes de estudos neuropatológicos. O comprimento dos axônhonas cholinergicgic, dopaminergice e sorotonergicos em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com as funções específicas da região. Como a distribuição desses axôlos é geralmente heterogênea, a estereorologia baseada em design é usada para evitar viés durante a amostragem. A sonda de bola espacial da estereorologia foi projetada para fornecer medidas eficientes e confiáveis de estruturas semelhantes a linhas, como fibras neuronais em uma região de interesse¹. A sonda faz uma esfera virtual que é imposta sistematicamente no tecido para medir intersecções de linha com a superfície da sonda. Por ser impossível colocar sondas de esfera no tecido para análise, o software comercialmente disponível fornece uma esfera virtual tridimensional (3D), que é basicamente uma série de círculos concêntricos de vários diâmetros que representam a superfície da sonda esfera.

A neurodegeneração colinérgica seletiva é uma das características consistentes da doença de Alzheimer (AD)^2,3,4. A transmissão colinérgica disfuncional é considerada um fator causal para o declínio cognitivo em AD. A disfunção colinérgica também é evidente em muitos outros transtornos mentais, como Parkinson, vício e esquizofrenia. Diferentes aspectos da neurodegeneração cholinergicsão são estudados em modelos animais (por exemplo, redução na acetilcolina^5,proteína ChAT^6,neurodegeneração de fibras cholinergicas nas proximidades de placas amiloides⁶, e diminuição em fibras cholinergic e varicos sinápticos^7,8). Acredita-se que a degeneração da fibra ocorra antes da perda neuronal, porque a perda neuronal cholinergica nem sempre é observada em estudos. A maioria dos neurônios colinérgicos estão no cérebro basal e no tronco cerebral, e seus axôlos projetam para várias regiões cerebrais, como os cortices e o hipocampo. O NBM está situado no cérebro basal e descobriu-se ser uma das áreas cerebrais comumente afetadas em D.C.

O método fracionário da estereologia baseia-se na amostragem aleatória sistemática de um tecido em múltiplos níveis. A fração amostral de seção (SSF) é a amostragem sistemática não baseada em computador de seções para o método fracionário de estereology. A fração amostral de área (ASF) é a fracionamento de uma área da região de interesse no trecho. Fração amostral de espessura (TSF) é a fracionamento da espessura de uma seção. A sonda de bola espacial nos permite quantificar perfis de interesse em uma esfera 3D em locais fracionados. Aqui usamos uma sonda de bola espacial para estimar o comprimento total das fibras cholinergic no NBM do cérebro do rato para ilustrar os procedimentos. O protocolo atual fornece detalhes sobre processamento de tecidos, métodos de amostragem para estereology, coloração imunohistoquímica usando o anticorpo ChAT e estereorologia imparcial para estimar o comprimento da fibra cholinergice e a densidade de fibras no NBM do cérebro do rato.

Protocol

Todos os procedimentos para o uso desses animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais do Centro de Idosos de Kansas City. Camundongos de 18 meses de idade superexpressam proteína precursora beta-amilóide sueca (APPswe) e seus companheiros de lixo C57/BL6 WT foram usados para os experimentos. Detalhes da reprodução e genotipagem são dados em He et al.8. 1. Perfusão e processamento de tecidos Camundongos anestesiados uti…

Representative Results

Os resultados representativos são mostrados na Tabela 1 e Figura 5. O Grupo C, que foi decodificado como APPswe Group (APP), teve comprimento de fibra significativamente menor (Figura 5B) e densidade de comprimento de fibra(Figura 5C) em comparação com seus companheiros de lixo tipo selvagem (WILD). Os resultados mostraram que não houve diferença significativa no volume do NBM …

Discussion

Aqui demonstramos um método para estimar a densidade de fibras cholinergic no NBM usando uma sonda de esfera espacial (esfera). Esta sonda estima o comprimento total da fibra na região de interesse. O comprimento total pode ser dividido pelo volume da região para obter a densidade da fibra. Para estimar o volume da região, utilizou-se o método de contagem de pontos Cavalieri. O método de contagem de pontos Cavalieri é um estimador imparcial e eficiente de um volume de referência 3D para qualquer região. O métod…

Materials

ABC kit	Vector Laboratories	PK6100
Anti-ChAT Antibody	Millipore, MA, USA	AB144P
Bovine anti-goat IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
Bovine Serum, Adult	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	B9433
Cryostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
Ethylene Glycol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	324558
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G2025
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1009
Immpact-DAB kit	Vector Laboratories	SK4105	Enhanced DAB peroxidase substrate solution
Ketamine	Westward Pharmaceuticals, NJ, USA	0143-9509-01
Microscope	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA	AF6000	Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera
Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	62550-12
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P6148
Permount mounting medium	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
Stereologer Software	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	Installed on a Dell Desktop computer.
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris base
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris hydrochloride
Xylazine	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
Xylenes, Histological grade	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056