Lunghezza della fibra neuronale all'interno di una struttura tridimensionale di una regione del cervello è un parametro affidabile per quantificare specifica integrità strutturale neuronale o degenerazione. Questo articolo descrive in dettaglio un metodo di quantificazione stereologica per misurare la lunghezza della fibra colinergica all'interno del nucleo basalis di Meynert nei topi come esempio.
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Articolo metodologico
Stima stereologica della lunghezza della fibra colinergica nel Nucleus Basalis di Meynert del cervello del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La lunghezza degli assoni colinergici o di altri neuronali in varie regioni del cervello è spesso correlata con la funzione specifica della regione. La stereologia è un metodo utile per quantificare i profili neuronali di varie strutture cerebrali. Qui forniamo un protocollo di stereologia basato su software per stimare la lunghezza totale delle fibre colinergiche nel nucleo basalis di Meynert (NBM) del prosencefalo basale. Il metodo utilizza una sonda a sfera spaziale per le stime di lunghezza. Le fibre collinergiche sono visualizzate da colina acetiltransferasi (ChAT) immunostaining con il rafano peroxidase-diaminobenzidina (HRP-DAB) sistema di rilevamento. Il protocollo di colorazione è valido anche per la stima della fibra e del numero di cellule in varie regioni del cervello utilizzando software di stereologia. Il protocollo di stereologia può essere utilizzato per la stima di eventuali profili lineari come fibre coccolincettive, fibre dopaminergiche/catecholaminergiche, fibre sitonergiche, processi astrociti, o anche profili vascolari.
Introduzione
Le stime quantitative della lunghezza e/o della densità delle fibre nervose nel cervello sono parametri importanti degli studi neuropatologici. La lunghezza degli assoni colinergici, dopaminergici e sierotonergici in varie regioni del cervello sono spesso correlati con le funzioni specifiche della regione. Poiché la distribuzione di questi assoni è generalmente eterogenea, la stereologia basata sulla progettazione viene utilizzata per evitare distorsioni durante il campionamento. La sonda spaziale di stereologia è stata progettata per fornire misure efficienti e affidabili di strutture simili a linee come le fibre neuronali in una regione di interesse
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Protocollo
Tutte le procedure per l'utilizzo di questi animali sono state approvate dal Kansas City Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee. Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi di 18 mesi che sovraesprimono la proteina precursore del beta-amiloide mutante svedese (APPPawe) e i loro compagni di cucciolata C57/BL6 WT. I dettagli dell'allevamento e della genotipizzazione sono forniti in Egli et al.8.
1. Perfusione e lavorazione dei tessuti
- Anestesia topi con iniezione intraperitoneale con ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Avvicinare le dita dei dati per confermare ....
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Risultati
I risultati rappresentativi sono riportati nella tabella 1 e nella figura 5. Il gruppo C, che è stato decodificato come gruppo APPswe (APP), aveva una lunghezza della fibra significativamente inferiore (Figura 5B) e densità di lunghezza della fibra (Figura 5C) rispetto ai loro compagni di cucciolata di tipo selvaggio (WILD). I risultati hanno mostrato che non vi era alcuna differenz.......
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Discussione
Qui dimostriamo un metodo per stimare la densità delle fibre colinergiche nel NBM utilizzando una sonda palla spaziale (sfera). Questa sonda stima la lunghezza totale della fibra nella regione di interesse. La lunghezza totale può essere divisa per il volume della regione per ottenere la densità della fibra. Per stimare il volume della regione, è stato utilizzato il metodo di conteggio punti Cavalieri. Il metodo di conteggio punti Cavalieri è uno stimatore imparziale ed efficiente di un volume di riferimento 3D per quals.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a W.E.S. dal Servizio di Ricerca e Sviluppo Medica, dal Dipartimento degli Affari Veterani (Recensione del Merito 1I01 BX001067-01A2), dall'Alzheimer (NPSPAD-11-202149) e dalle risorse del Midwest Biomedical Fondazione di Ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit ABC | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anticorpo Anti-ChAT | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Anti-capra bovina IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Siero bovino, Adulto | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Glicole etilenico | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | Perossido di idrogeno G2025 | |
| Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | Kit H1009 | ||
| Immpact-DAB | Vector Laboratories | SK4105 | Soluzione potenziata del substrato della perossidasi DAB |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscopio | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Dotato di tavolino motorizzato e fotocamera digitale a colori IMI-tech |
| Temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) che incorpora il mezzo | Microscopia elettronica Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Mezzo di montaggio Permount | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installato su un computer desktop Dell. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base Trizma |
| cloridrato | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris cloridrato |
| Xilazina | Bayer, Leverkusen, Germania | Rompun | |
| Xylenes, grado istologico | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
Riferimenti
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, Pt 1 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer dise....
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Ristampe e permessi
