Fare Beyninin Meynert'in Nükleus Bazalisinde Kolinerjik Lif Uzunluğunun Stereoolojik Tahmini
Summary
Bir beyin bölgesinin üç boyutlu yapısı içinde nöronal lif uzunluğu belirli nöronal yapısal bütünlüğü veya dejenerasyon ölçmek için güvenilir bir parametredir. Bu makalede, farelerde Meynert’in çekirdek bazalisi içindeki kolinerjik lif uzunluğunu ölçmek için stereoolojik bir niceliksel leştirme yöntemi örnek olarak açıklanır.
Abstract
Çeşitli beyin bölgelerinde kolinerjik veya diğer nöronal aksonların uzunluğu genellikle bölgenin özel fonksiyonu ile ilişkilidir. Stereoloji çeşitli beyin yapılarının nöronal profillerini ölçmek için yararlı bir yöntemdir. Burada bazal ön beynin Meynert (NBM) çekirdeğindeki kolinerjik liflerin toplam uzunluğunu tahmin etmek için yazılım tabanlı stereoloji protokolü salıyoruz. Yöntem uzunluk tahminleri için bir uzay topu sondası kullanır. Kolinerjik lifler kolin asetiltransferaz tarafından görselleştirilmiştir (ChAT) horseradish peroksidaz-diaminobenzidin ile immünboyama (HRP-DAB) algılama sistemi. Boyama protokolü, stereoloji yazılımı kullanılarak çeşitli beyin bölgelerinde lif ve hücre sayısı tahmini için de geçerlidir. Stereoloji protokolü cholinoceptive lifler, dopaminerjik / katekolaminerik lifler, serotonerjik lifler, astrosit süreçleri, hatta vasküler profiller gibi herhangi bir lineer profillerin tahmini için kullanılabilir.
Introduction
Beyindeki sinir liflerinin uzunluğu ve/veya yoğunluğunun nicel tahminleri nöropatolojik çalışmaların önemli parametreleridir. Çeşitli beyin bölgelerinde kolinerjik uzunluğu, dopaminerjik, ve serotonerjik aksonlar genellikle bölgenin belirli fonksiyonları ile ilişkilidir. Bu aksonların dağılımı genellikle heterojen olduğundan, tasarım tabanlı stereoloji örnekleme sırasında önyargıönlemek için kullanılır. Stereolojiuzay topu sondası ilgi bir bölgede nöronal lifler gibi çizgi benzeri yapıların verimli ve güvenilir önlemler sağlamak için tasarlanmıştır1. Sonda, sondanın yüzeyi ile çizgi kesişmelerini ölçmek için dokuya sistematik olarak empoze edilen sanal bir küre yapar. Analiz için dokuya küre sondaları koymak mümkün olmadığından, ticari olarak kullanılabilen yazılım sanal üç boyutlu (3D) bir küre sağlar, bu da temelde küre sondasının yüzeyini temsil eden çeşitli çaplarda eşmerkezli daireler dizisidir.
Selektif kolinerjik nörodejenerasyon Alzheimer hastalığının tutarlı özelliklerinden biridir (AD)2,3,4. Disfonksiyonel kolinerjik iletim AD bilişsel gerileme için bir etken olarak kabul edilir. Kolinerjik disfonksiyon da Parkinson gibi diğer birçok ruhsal bozukluklar belirgindir, bağımlılık, ve şizofreni. Kolinerjik nörodejenerasyon farklı yönleri hayvan modellerinde incelenir (örneğin, asetilkolin azalma5, ChAT protein6, amiloid plaklar çevresinde kolinerjik lif nörodejenerasyon6, ve kolinerjik lifler ve sinaptik varisleri azalma7,8). Lif dejenerasyonu nöronal kayıp daha erken yer olduğuna inanılmaktadır, kolinerjik nöronal kaybı her zaman çalışmalarda gözlenmez çünkü. Kolinerjik nöronların çoğu bazal ön beyin ve beyin sapı, ve korteksler ve hipokampus gibi çeşitli beyin bölgelerine aksonlar proje. NBM bazal ön beyin de bulunan ve AD yaygın olarak etkilenen beyin bölgelerinden biri olarak bulundu.
Stereolojinin fraksiyonator yöntemi, bir dokunun birden fazla düzeyde sistematik olarak rastgele örneklemesi üzerine kuruludur. Kesit örnekleme fraksiyonu (SSF), stereolojinin fraksiyonator yöntemi için bölümlerin bilgisayar tabanlı olmayan sistematik örneklemesidir. Alan örnekleme fraksiyonu (ASF), bu bölümdeki ilgi alanının bir bölümünün fraksiyonudur. Kalınlık örnekleme fraksiyonu (TSF) bir bölümün kalınlığının kesirasyonudur. Uzay topu sondası, kesirli yerlerde 3Boyutlu bir küredeki ilgi profillerini ölçmemizi sağlıyor. Burada prosedürleri göstermek için fare beyninin NBM kolinerjik liflerin toplam uzunluğu tahmin etmek için bir uzay topu sondası kullanın. Mevcut protokol doku işleme hakkında ayrıntılı bilgi sağlar, stereoloji için örnekleme yöntemleri, ChAT antikor kullanarak immünohistokimyasal boyama, ve tarafsız stereoloji fare beyninin NBM kolinerjik lif uzunluğu ve lif yoğunluğu tahmin etmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bir uzay topu (küre) sondası kullanarak NBM kolinerjik liflerin yoğunluğunu tahmin etmek için bir yöntem göstermektedir. Bu sonda, ilgi bölgesindeki toplam lif uzunluğunu tahmin ediyor. Toplam uzunluk lif yoğunluğu elde etmek için bölgenin hacmine bölünebilir. Bölgenin hacmini tahmin etmek için Cavalieri nokta sayımı yöntemi kullanılmıştır. Cavalieri puan sayımı yöntemi, herhangi bir bölge için 3B referans hacminin tarafsız ve verimli bir tahmincisidir. Yöntem, noktaları (alan kesir…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma W.Z.S.’ye Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Servisi, Gazi İşleri Dairesi (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), Alzheimer Derneği (NPSPAD-11-202149) ve Midwest Biyomedikal kaynaklarından gelen bağışlarla desteklenmiştir. Araştırma Vakfı.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
Riferimenti
- Mouton, P. R., Gokhale, A. M., Ward, N. L., West, M. J. Stereological length estimation using spherical probes. Journal of Microscopy. 206, 54-64 (2002).
- Whitehouse, P. J., Price, D. L., Clark, A. W., Long Coyle, J. T., DeLong, M. R. Alzheimer disease: evidence for selective loss of cholinergic neurons in the nucleus basalis. Annals of Neurology. 10 (2), 122-126 (1981).
- Davies, P., Maloney, A. J. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer’s disease. The Lancet. 2 (8000), 1403 (1976).
- Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., Lippa, A. S. The cholinergic hypothesis of geriatric memory dysfunction. Science. 217 (4558), 408-414 (1982).
- Savonenko, A. Episodic-like memory deficits in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease: relationships to beta-amyloid deposition and neurotransmitter abnormalities. Neurobiology of Disease. 18 (3), 602-617 (2005).
- Perez, S. E., Dar, S., Ikonomovic, M. D., DeKosky, S. T., Mufson, E. J. Cholinergic forebrain degeneration in the APPswe/PS1DeltaE9 transgenic mouse. Neurobiology of Disease. 28 (1), 3-15 (2007).
- Stokin, G. B. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
- He, M. GRK5 Deficiency Leads to Selective Basal Forebrain Cholinergic Neuronal Vulnerability. Scientific Reports. 6, 26116 (2016).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Mouton, P. R. . Unbiased Stereology-A Concise Guide. , (2011).
- West, M. J. Getting started in stereology. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (4), 287-297 (2013).
- West, M. J. Space Balls Revisited: Stereological Estimates of Length With Virtual Isotropic Surface Probes. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 49 (2018).
- Nikolajsen, G. N., Kotynski, K. A., Jensen, M. S., West, M. J. Quantitative analysis of the capillary network of aged APPswe/PS1dE9 transgenic mice. Neurobiology of Aging. 36 (11), 2954-2962 (2015).
- Gutierrez-Jimenez, E. Disturbances in the control of capillary flow in an aged APP(swe)/PS1DeltaE9 model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging. 62, 82-94 (2018).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B., Kieu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology–reconsidered. Journal of Microscopy. 193, 199-211 (1999).
- Zhang, Y. Quantitative study of the capillaries within the white matter of the Tg2576 mouse model of Alzheimer’s disease. Brain and Behavior. 9 (4), 01268 (2019).
- McNeal, D. W. Unbiased Stereological Analysis of Reactive Astrogliosis to Estimate Age-Associated Cerebral White Matter Injury. Journal of Neuropathology Experimental Neurology. 75 (6), 539-554 (2016).
- Liu, Y. Passive (amyloid-beta) immunotherapy attenuates monoaminergic axonal degeneration in the AbetaPPswe/PS1dE9 mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 23 (2), 271-279 (2011).
- Gagnon, D. Evidence for Sprouting of Dopamine and Serotonin Axons in the Pallidum of Parkinsonian Monkeys. Frontiers of Neuroanatomy. 12, 38 (2018).
- Boncristiano, S. Cholinergic changes in the APP23 transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Journal of Neuroscience. 22 (8), 3234-3243 (2002).
