פיתוח של מודלים murine עם גנים ספציפיים מוטציה בראש ובצוואר חולי סרטן נדרש להבנת neoplasia. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור שינוי בלתי מתורבת של תאי הלשון הראשי murine באמצעות מערכת וירוס הקשורים adeno-Cas9 כדי ליצור קווים מורין HNC התאים עם שינויים גנומית ספציפיים.
השימוש בתאי אפיתל הראשוני נורמלי מאפשר ליצור לגרום לשינויים גנומית נדרש עבור שינוי הסלולר על ידי החדרת מוטציות ספציפיות אונגנים וגנים מדכא הגידול, באמצעות במרווחים רגולציה באשכולות לחזור קצר palindromic (CRISPR)-מבוססי הגנום עריכת טכנולוגיה בעכברים. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לחקות במדויק את השינויים הגנטיים המתרחשים בסרטן האנושי באמצעות עכברים. על ידי שינוי גנטי מהפך תאים ראשוניים, אנחנו יכולים ללמוד טוב יותר התפתחות סרטן, התקדמות, טיפול, ואבחון. במחקר זה, השתמשנו inducible Cas9 לשון העכבר תאים אפיתל כדי לאפשר עריכת הגנום באמצעות וירוס הקשורים adeno (AAV) ב מבחנה. באופן ספציפי, על ידי שינוי קראס, p53, ו APC בתאי האפיתל הלשון נורמלי, הצלחנו הראש מורנין סרטן הצוואר (HNC) קו מחוץ לתחום, אשר הוא הטמורגניים בעכברים syngeneic. השיטה המוצגת כאן מתארת בפרוטרוט כיצד ליצור קווי התאים HNC עם שינויים גנומית ספציפיים ומסביר התאמה שלהם לחיזוי התקדמות הגידול בעכברים syngeneic. אנו לדמיין כי זו שיטה מבטיחה יהיה אינפורמטיבי ושימושי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול וטיפול של HNC.
HNC הוא ממאירות נפוצה ברחבי העולם1. מידול בראשית של HNC neoplasia נמצא כעת נקודת מפנה מדעית2. בעוד מוטציות גנטיות רבות זוהו hnc2,3,4 (למשל, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, ו RAS) שילובים ספציפיים של שינויים גנותיים נדרש בקונצרט כדי לגרום hnc להישאר ברור.
השימוש הנוכחי בקווי התאים האנושיים HNC עזר באופן משמעותי כדי להבהיר את המנגנונים הקשורים בפתוגנזה וטיפול3. עם זאת, המחקר של קווי התאים האנושיים במערכות murine החיסונית יש המגבלות שלה, כי מערכות אלה אינם מטפלים בתהליך vivo נאופלסטי, התפקיד של מוטציות גנים ספציפיים, ותגובות טיפול במיקרו הסביבה החיסונית. מכאן, הפיתוח והקמתה של קווי תא מורטין עם שינויים גנטיים ספציפיים הם בעלי חשיבות עיקרית ללמוד כיצד גנים שונים תורמים לתהליך הטרנספורמציה ולבדוק טיפולים מבוססי מולקולה הרומן עכברים המוסמכת.
לימודי התפקוד הגנטי במחקרים ביו-רפואיים הושפעו באופן משמעותי מהתקדמות בטכנולוגיות לעריכת דנ א, על ידי החדרת הפסקות כפולות (DSBs), לדוגמה5. טכנולוגיות אלה, כולל שימוש בנוקלאוסים של אצבעות אבץ, שעתוק activator-כמו אפקטור נוקלאוסיס, ומקובצים באשכולות במרווחים של הרגולציה הבין-מפרידים (CRISPR/Cas9), מאפשרים מניפולציה של כל גן התעניינות בלוקוס. מערכות crispr האחרונה/Cas9 מורכב מדריך RNA (grna) המכוון את Cas9 נוקלאז כדי ליצור dsb באתר ספציפי בגנום. מערכת זו צברה הכרה נרחבת בשינוי גנים אנדוגני בתוך כל תא או רקמות היעד, אפילו באופן מסורתי קשה לטפל באורגניזמים5. יש לו יתרונות רבים על מערכות אחרות בשל פשטותו, מהירות, ויעילות.
באונקולוגיה, CRISPR/CAS9 הטכנולוגיה מילא את הצורך לחקות ביעילות תאים סרטניים. כדי להקים מערכת זו ב HNC, אנו מניפולציות קראס אואונגן חזק ושני גנים מדכא הגידול חשוב, APC ו p536. על פי מסד הנתונים של ג ‘ יני7, שילוב זה נדיר ב hnc. מוטציות RAS (HRAS, NRAS, ו קראס) קיימים רק ~ 7% של כל אוכלוסיית HNC. גידולים אלה נוטים להיות עמידים לטיפול8,9.
משלוח של Cas9 ו gRNA שלה מושגת באמצעות התמרה ויראלית באמצעות AAVs או לנטיאוירוסים. רקומביננטי AAV הוא לעתים קרובות את השיטה המועדפת לאספקת גנים כדי למקד את התאים בשל titer גבוה שלה, התגובה החיסונית מתון, היכולת לשנות מגוון רחב של תאים, ובטיחות כוללת. באמצעות מערכת AAV, שונים מסוימים רקמות תא העכבר נוצרו, וקווי תא חדש עדיין מפותחים10,11,12. עם זאת, מערכת יעילה של עריכת גנומית שיכולה ליצור קו התאים של murine HNC הדגמים שרידים להתפתח. במחקר זה, אנו ביקשו לפתח במערכת מבוססת על מבחנה AAV-Cas9 להפיכת תאי הלשון הראשוניים של מורלין למצב הטומורגניים. זה ייחודי CRISPR/Cas9 פרוטוקול הטרנספורמציה ואת קו הגידול הוקם התא ניתן להשתמש כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של HNC הנגרמת על ידי מגוון של שינויים גנומית.
מספר שיטות שימשו בעבר כדי לשנות את התאים הראשוניים בתרבות עם דרגות משתנה של הצלחה25,26,27,28. רוב השיטות האלה להשתמש העכבר פיברוההדף תאים עבור שינוי14,17,18,19</…
The authors have nothing to disclose.
אנו מבקשים להודות לד ר דניאל גידלר על שסיפק לנו את הפלביניים של הדלתא 5. עבודה זו ממומנת ע י הקרן הישראלית למדע, 700/16) (ME), הקרן הלאומית למדעי המדינה-ישראל (BSF, 2017323) (לי ו-MS), האגודה הישראלית לסרטן (ICA, 20170024) (לי), הקרן הישראלית לחקר הסרטן (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME), והקרן הדאגה (#7895) (לי). מלגת מלגות: מלגת אלון בשבילי ובאוניברסיטת בן גוריון במלגות ל-SJ ו-MP.
Antibodies | |||
Anti mouse HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | |
Anti rabbit HRP | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | |
Cas9 Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 14697 | |
Cre | BioLegend | 900901 | |
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-062 | |
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | |
GFP | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) | Cell Signaling Technology | 4370 | |
Rabbit monoclonal anti E cadherin | Cell Signaling Technology | 3195S | |
Rabbit monoclonal anti-KRT 14 | Abcam | AB-ab181595 | |
β actin | MP Biomedicals | 691001 | |
β catenin | Cell Signaling Technology | 9582S | |
Cell lines | |||
HEK93T | ATCC | CRL-3216 | |
Culture Media, Chemicals and Reagents | |||
Bradford Reagent | Bio-Rad | 30015484 | |
BSA | Amresco | 0332-TAM-50G | |
DAPI fluoromount | Southern Biotech | 0100-20 | |
DMEM | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 01-055-1A | |
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0) | Cyanagen | XLS3.0100 and XLS071.0250 | |
FBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 04-127-1A | |
HBSS | Sigma | H6648 | |
Heparin – Agarose | Sigma | H6508 | |
Isolate II Genomic DNA Kit | Bioline | BIO-52066 | |
MgCl2 | Panreac AppliChem | 300283 | |
NaCl | Bio Lab Ltd | 1903059100 | |
PBS | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 02-023-1A | |
PEI | Polysciences | 23966-1 | |
Pen Strep Solution | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-031-1B | |
PFA | Santa Cruz Biotechnology | 30525-89-4 | |
Phosphatase inhibitor cocktail | Biotool | B15001A/B | |
Protease inhibitor cocktail | MilliporeSigma | P2714-1BTL | |
Tris buffer | MERCK Millipore | 648311-1KG | |
Enzymes | |||
Benzonase | Sigma | E1014 | |
Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
DNAse | Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3506 | |
Trypsin | Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. | 03-050-1B | |
Glass wares | |||
Cover slips | Bar Naor | BNCB00130RA1 | |
Slides | Bar Naor | BN9308C | |
Mouse strains | |||
C57BL/6 | Envigo | ||
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J | Jackson labs | 24857 | |
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | Envigo | ||
Plasmids | |||
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR | Broad Institute of MIT | Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA | |
AAV 2/9 capsid vector | Addgene | 112865 | |
pAD Delta F5 helper | Ben Gurion University of the Negev | Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel. | |
Plastic wares | |||
Amicon-ULTRA filter 100 KDa | Millipore | UFC910024 | |
0.22 µm sterile filters, 4 mm | Millex | SLGV004SL | |
0.45 µm sterile filters, 13 mm | Millex | SLHV013SL | |
Culture plates | Greiner Bio-One | ||
Falcon tubes | Greiner Bio-One |