Microscopia di trazione integrata con microfluidica per la migrazione collettiva chemiotattica

Summary

La migrazione collettiva delle cellule nello sviluppo, nella guarigione delle ferite e nella metastasi del cancro è spesso guidata dai gradienti dei fattori di crescita o delle molecole di segnalazione. Descritto qui è un sistema sperimentale che combina la microscopia a trazione con un sistema microfluidico e una dimostrazione di come quantificare la meccanica della migrazione collettiva in gradiente biochimico.

Abstract

Le cellule cambiano i modelli di migrazione in risposta a stimoli chimici, compresi i gradienti degli stimoli. La migrazione cellulare nella direzione di un gradiente chimico, noto come chemiotassi, svolge un ruolo importante nello sviluppo, nella risposta immunitaria, nella guarigione delle ferite e nella metastasi del cancro. Mentre la chemiotassi modula la migrazione di singole cellule e raccolte di cellule in vivo, la ricerca in vitro si concentra sulla chemiotassi una singola cellula, in parte a causa della mancanza di strumenti sperimentali adeguati. Per colmare questa lacuna, descritta qui c'è un sistema sperimentale unico che combina microfluidica e micropatterning per dimostrare gli effetti dei gradienti chimici sulla migrazione collettiva delle cellule. Inoltre, la microscopia a trazione e la microscopia a stress monomerio sono incorporate nel sistema per caratterizzare i cambiamenti nella forza cellulare sul substrato e tra le cellule vicine. Come prova di concetto, la migrazione di isole circolari micromodellate di cellule renali canine Madin-Darby (MDCK) è testata sotto un gradiente di fattore di crescita epatociti (HGF), un fattore di dispersione noto. Si trova che le cellule situate vicino alla maggiore concentrazione di HGF migrano più velocemente di quelle sul lato opposto all'interno di un'isola cellulare. All'interno della stessa isola, la trazione cellulare è simile su entrambi i lati, ma lo stress intercellulare è molto più basso sul lato di una maggiore concentrazione di HGF. Questo nuovo sistema sperimentale può fornire nuove opportunità per studiare la meccanica della migrazione chemiotattica da parte dei collettivi cellulari.

Introduction

La migrazione cellulare nei sistemi biologici è un fenomeno fondamentale coinvolto nella formazione dei tessuti, nella risposta immunitaria e nella guarigione delle ferite^1,2,3. La migrazione cellulare è anche un processo importante in alcune malattie come il cancro⁴. Le celle spesso migrano come un gruppo piuttosto che singolarmente, che è noto come migrazione collettiva di celle^4,5. Affinché le cellule si muovano collettivamente, il rilevamento del microambiente è essenziale^....

Protocol

NOTA: La litografia degli stampi SU-8 per gli stencil (spessore - 250 m) e le parti microcanale (spessore - 150 m), l'incisione in vetro (profondità : 100 m) e la fabbricazione della casta sono state esternalizzate inviando progetti utilizzando software di progettazione assistiti da computer ai produttori.

1. Fabbricazione di stencil polidimethylsixane (PDMS) e microcanale

1. Progettare il micromodello di stencil e microcanale.
2. Fabbricare o esternalizzare stampi SU-8 (spessore di 250 m per gli stencil e di 150 m per i microcanali) su wafer di silicio (4" di adiemetro).
3. Preparare la miscela PDMS mescolando l'elasto....

Results

Per esplorare la migrazione collettiva in un gradiente chimico, un sistema microfluidico è stato integrato con la microscopia a trazione (Figura 1). Per costruire il sistema integrato, il gel di poliacrilammide (PA) è stato gettato su vetro tagliato su misura, e le cellule MDCK sono state semiate all'interno di isole micromodellate fatte da uno stencil PDMS. Per questo esperimento, sono state create dodici isole di celle MDCK (quattro righe per tre colonne, diametro di 700 m). Dopo aver atta.......

Discussion

La migrazione collettiva delle cellule costitutive è un processo importante durante lo sviluppo e la rigenerazione, e la direzione di migrazione è spesso guidata dal gradiente chimico dei fattori di crescita^4,23. Durante la migrazione collettiva, le cellule continuano a interagire con le cellule vicine e i substrati sottostanti. Tali interazioni meccaniche danno origine a fenomeni emergenti come durotaxis⁴², plithotaxis^33.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% tripsina-EDTA (1X)	Gibco	25200-056
Soluzione tampone HEPES 1 M	Gibco	15630-056
Punzone per biopsia da 1 mm	Integra Miltex	33-31AA-P/25
Piastre di Petri da 100 mm	SPL	10100	diametro 100 mm, altezza 15
mm Punzone cavo	ILJIN	124-0571
18 mm Ø Vetrino coprioggetti	Marienfeld-Superior	111580	Circolare 18 mm, spessore n. 1 (da 0,13 a 0,16 mm)
Soluzione di bis-acrilammide al 2%	Bio-Rad	1610142	Indossare guanti, indumenti protettivi e protezione per gli occhi.
3-(Trimetossisilil)metacrilato di propile (TMSPMA)	Sigma-Aldrich	440159-500ML
Rubinetto a 3 vie	Hyupsung	HS-T-61N	ATTENZIONE: non utilizzare se precedentemente aperto. non risterilizzare o riutilizzare
linea del volume minimo di 30 cm (per pediatrico)	Hyupsung	HS-MV-30	ATTENZIONE: non utilizzare se precedentemente aperto. non risterilizzare o riutilizzare
la piastra di coltura cellulare da 35 mm	Corning
soluzione di acrilammide al 40%	Bio-Rad	1610140	Indossare guanti, indumenti e protezione per gli occhi protettivi.
Linea di volume minimo 75 cm (per pediatrica)	Hyupsung	HS-MV-75	ATTENZIONE: non utilizzare se precedentemente aperto. non sterilizzare o riutilizzare
acido acetico	J.T. Baker	JT9508-03
Persolfato di ammonio (APS)	Bio-Rad	1610700
Antibiotico-Antimicotico	Gibco	15240-062
Chip di vetro inferiore	MicroFIT		24 x 24 x 1 mm, su misura, scanalatura rettangolare (6 x 12 mm, profondità : 100 μ m)
Collagene di tipo I, coda di ratto	Corning	354236
Portabicchieri personalizzato	Han-Gug Mechatronics	su misura
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Welgene	LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biowest	L0615-500	w/o Magnesio, Calcio
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	26140-179
FluoSpheres microsfere modificate con ammina	Invitrogen	F8764	0.2 &; m, fluorescente giallo-verde (505/515)
Fattore di crescita degli epatociti (HGF)	Sigma-Aldrich	H1404-5UG	ricombinante,
sistema di imaging di cellule vive umane in stadio JuLI	NanoEnTek In		stadio X-Y-Z automatizzato e imaging fluorescente Compatibile con incubatore (37 ° C e 5% CO2)
Madin-Darby Canino Rene (MDCK) cellula			di tipo II
Sistema di plasma a ossigeno	Femto Science	CUTE-MPR
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
Isotiocianato di rodamina B... destrano	Sigma-Aldrich	R9379-100MG	70 kDa, utilizzato per stimare la distribuzione spazio-temporale dell'HGF nel canale microfluidico
Ago ipodermico sterile 18 G	KOVAX		Tagliare la punta dell'ago e piegarla di 90 gradi per collegare le porte di ingresso/uscita con la linea del volume
Nastro adesivo	3M/Scotch	810D	33 m x 19 mm
Stampi master SU-8	MicroFIT		4 pollici diametro, su misura
sulfosuccinimidil 6-(4'-azido-2'-nitrofenilammino)esanoato (Sulfo-SANPAH)	Thermo Scientific	22589	Conservare a -20°C. Conservare al riparo dall'umidità e dalla luce.
Sylgard 184 Kit elastomero	Dow Corning		PDMS
Pompa a siringa	Chemyx Inc.	modello fusion 720	prelevare il fluido
Siringhe	KOVAX		1, 3, 5, 10 o 50 cc per l'utilizzo del serbatoio di ingresso o di uscita della pompa a siringa
tetrametiletilendiammina (TEMED)	Bio-Rad	1610800	Indossare guanti, indumenti protettivi e protezione per gli occhi.
Lampada ultravioletta	UVP LLC	95-0248-02	lunghezza d'onda 365 nm