Nous présentons un protocole général pour identifier de courtes étendues des séquences homologues de protéine d’hôte-pathogène (SSHHPS) incorporées dans la polyprotéine virale. Le SSHHPS est reconnu par les protéases virales et dirige la destruction ciblée de protéines hôtes spécifiques par plusieurs virus du groupe IV.
Les enzymes alphavirales sont synthétisées en un seul polypeptide. La polyprotéine non structurelle (nsP) est traitée par sa protéase de cystéine nsP2 pour produire des enzymes actives essentielles à la réplication virale. Les protéases virales sont très spécifiques et reconnaissent les séquences de motifs de site de clivage conservés (6-8 acides aminés). Dans plusieurs virus du groupe IV, les séquences de motifs du site de clivage nsP peuvent être trouvées dans des protéines hôtes spécifiques impliquées dans la génération des réponses immunitaires innées et, dans certains cas, les protéines ciblées semblent être liées au phénotype induit par le virus. Ces virus utilisent de courtes étendues de séquences de protéines homologues hôte-pathogène (SSHHPS) pour la destruction ciblée des protéines hôtes. Pour identifier SSHHPS les séquences virales de motif de clivage de clivage de protéase peuvent être entrées dans BLAST et les génomes d’hôte peuvent être recherchés. Le clivage peut d’abord être testé à l’aide des substrats purifiés de protéase virale nsP et de transfert d’énergie par résonance fluorescence (FRET) fabriqués dans E. coli. Les substrats FRET contiennent des protéines fluorescentes cyan et jaune et la séquence du site de clivage (CFP-séquence-YFP). Cet analyse de protéase peut être utilisé en continu dans un lecteur de plaque ou discontinu dans les gels SDS-PAGE. Des modèles des substrats de peptide liés peuvent être générés en silico pour guider la sélection des substrats et les études de mutagénèse. Des substrats CFP/YFP ont également été utilisés pour identifier les inhibiteurs de la protéase. Ces méthodes in vitro et in silico peuvent être utilisées en combinaison avec des tests cellulaires pour déterminer si la protéine hôte ciblée affecte la réplication virale.
Les preuves de transfert horizontal de gènes d’un virus à l’hôte, ou d’un hôte à un virus, peuvent être trouvées dans une variété de génomes1,2,3,4. Des exemples d’endogène virale sont les séquences de l’espaceur CRISPR trouvées dans les génomes de l’hôte bactérien4. Récemment, nous avons trouvé des preuves de séquences de protéines hôtes incorporées dans les polyprotéines non structurelles des virus du groupe IV de l’ARNd. Ces séquences dans les régions codantes du génome viral peuvent être propagées de génération en génération. Les courtes étendues de séquences de protéines homologues hôte-pathogène (SSHHPS) se trouvent dans le virus et l’hôte5,6. SSHHPS sont les séquences de motif de site de clivage conservés reconnues par les protéases virales qui ont l’homologie aux protéines hôtes spécifiques. Ces séquences dirigent la destruction de protéines hôtes spécifiques.
Dans notre publication précédente6, nous avons compilé une liste de toutes les protéines hôtes qui ont été ciblées par les protéases virales et a constaté que la liste des cibles n’était pas aléatoire (tableau 1). Deux tendances étaient évidentes. Tout d’abord, la majorité des protéases virales qui ont coupé les protéines de l’hôte appartenaient à des virus du groupe IV (24 des 25 cas concernaient des protéases virales du groupe IV), et une protéase appartenait aux rétrovirus du groupe VI (VIH, virus de l’immunodéficience humaine)7. Deuxièmement, les cibles de protéine d’hôte étant coupées par les protéases virales ont été généralement impliquées en générant les réponses immunitaires innées suggérant que les clivages étaient destinés à contrarier les réponses immunitaires de l’hôte. La moitié des protéines hôtes visées par les protéases virales étaient des composants connus des cascades de signalisation qui génèrent de l’interféron (IFN) et des cytokines proinflammatoires(tableau 1). D’autres ont été impliqués dans la transcription de cellule hôte8,9,10 ou la traduction11. Fait intéressant, Shmakov et coll.4 ont montré que de nombreuses séquences protospacer CRISPR correspondent à des gènes impliqués dans la conjugaison ou la réplication du plasmide4.
Le groupe IV comprend, entre autres, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae et Togaviridae. Plusieurs pathogènes nouveaux et émergents appartiennent au groupe IV, comme le virus Zika (ZIKV), le Nil occidental (VNO), le chikungunya (CHIKV), le virus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) et le virus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS). Le génome de l’ARNm est essentiellement un morceau d’ARNm. Pour produire les enzymes nécessaires à la réplication du génome, le génome de l’ARNmdoit doit d’abord être traduit. Dans les alphavirus et autres virus du groupe IV, les enzymes nécessaires à la réplication sont produites en une seule polyprotéine (c.-à-d., nsP1234 pour VEEV). La polyprotéine non structurelle (nsP) est traitée protéolytiquement (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) par la protéase nsP2 pour produire des enzymes actives12 (figure 1). Le clivage de la polyprotéine par la protéase nsP2 est essentiel pour la réplication virale; ceci a été démontré par la suppression et la mutagénèse site-dirigée de la cystéine active de site de la protéase nsP213,14. Notamment, la traduction des protéines virales précède les événements de réplication du génome. Par exemple, nsP4 contient la polymérase d’ARN dépendante de l’ARN nécessaire pour reproduire le génome de l’ARNsde. La réplication du génome peut produire des intermédiaires dsRNA; ces intermédiaires peuvent déclencher les réponses immunitaires innées de l’hôte. Ainsi, ces virus peuvent couper l’hôte des protéines de réponse immunitaire innées au début de l’infection afin de supprimer leurs effets15,16,17.
Le silençage peut se produire au niveau de l’ADN, de l’ARN et des protéines. Ce qui est commun à chacun des mécanismes de silençage montrés dans la figure 1, c’est que de courts séquences d’ADN, d’ARN ou de protéines étrangères sont utilisées pour guider la destruction de cibles spécifiques afin de contrarier leur fonction. Les mécanismes de silence sont analogues aux programmes de « recherche et suppression » qui ont été écrits en trois langues différentes. La courte séquence du site de clivage est analogue à un « mot clé ». Chaque programme a une enzyme qui reconnaît la correspondance entre la séquence courte (le «mot clé») et un mot dans le «fichier» qui doit être supprimé. Une fois qu’une correspondance est trouvée, l’enzyme coupe (« supprime ») la séquence cible plus grande. Les trois mécanismes présentés à la figure 1 sont utilisés pour défendre l’hôte contre les virus ou pour défendre un virus contre le système immunitaire d’un hôte.
Les protéases virales reconnaissent les courtes séquences de motifs de site de clivage entre les acides aminés de 2-11 ; dans les nucléotides, cela correspondrait à 6-33 bases. À titre de comparaison, les séquences d’espaceurs CRISPR sont des nucléotides de 26 à 72 et les ARNi sont des nucléotides de 20-2218,19. Bien que ces séquences soient relativement courtes, elles peuvent être reconnues spécifiquement. Compte tenu de la plus grande diversité d’acides aminés, la probabilité d’un événement de clivage aléatoire est relativement faible pour une protéase virale reconnaissant des séquences protéiques de 6-8 acides aminés ou plus. La prédiction du SSHHPS dans les protéines hôtes dépendra en grande partie de la spécificité de la protéase virale examinée. Si la protéase a des exigences strictes de spécificité de séquence la chance de trouver une séquence de site de clivage est 1/206 – 1 dans 64 millions ou 1/208 – 1 dans 25.6 milliards ; cependant, la plupart des protéases ont des tolérances sous-sites variables (p. ex., R ou K peuvent être tolérés sur le site S1). Par conséquent, il n’y a aucune exigence d’identité de séquence entre les séquences trouvées dans l’hôte par rapport au virus. Pour les protéases virales qui ont des exigences de séquence plus lâches (comme celles appartenant à Picornaviridae), la probabilité de trouver un site de clivage dans une protéine hôte peut être plus élevée. Bon nombre des inscriptions au tableau 1 proviennent de la famille Picornaviridae.
Schechter et Berger notation20 est couramment utilisé pour décrire les résidus dans un substrat de protéase et les sous-sites auxquels ils se lient, nous utilisons cette notation tout au long. Les résidus dans le substrat qui sont N-terminal de la liaison scissile sont désignés comme P3-P2-P1 tandis que ceux qui sont C-terminal sont désignés comme P1′-P2′-P3′. Les sous-sites correspondants dans la protéase qui lient ces résidus d’acides aminés sont S3-S2-S1 et S1′-S2′-S3′, respectivement.
Pour déterminer quelles protéines hôtes sont ciblées, nous pouvons identifier Le SSHHPS dans les sites de clivage polyprotéine virale et rechercher les protéines hôtes qui les contiennent. Ici, nous dénoncons des procédures pour identifier SSHHPS utilisant les séquences connues de site de clivage de protéase virale. Les méthodes bioinformatiques, les essais de protéase, et dans les méthodes de silico décrites sont destinées à être utilisées en conjonction avec des essais cellulaires.
Les alignements séquences des protéines hôtes ciblées par les protéases virales ont révélé des différences spécifiques aux espèces au sein de ces courtes séquences de sites de clivage. Par exemple, la protéase nsP2 du virus de l’encéphalite équine vénézuélienne (VEEV) a été trouvée pour couper trim14 humain, un motif tripartite (TRIM) protéine6. Certaines protéines TRIM sont des facteurs de restriction virale (par exemple, TRIM521), la plupart sont considérés comme des ligases e3 d’ubiquitine. TRIM14 n’a pas de ring (vraiment intéressant nouveau gène) domaine et n’est pas considéré comme un E3 ligase22. TRIM14 a été proposé pour être un adaptateur dans le signalosome antiviral mitochondrial (MAVS)22, mais peut avoir d’autres fonctions antivirales23. L’alignement des séquences TRIM14 de diverses espèces montre que les équidés n’ont pas le site de clivage et abritent une version tronquée de TRIM14 qui manque le domaine C-terminal PRY/SPRY. Ce domaine contient un site de polyubiquitination (Figure 2). Chez les équines, ces virus sont très mortels (mortalité de 20 à 80 %) alors que chez l’homme, seulement 1 % meurent des infections à VEEV24. Le clivage du domaine PRY/SPRY peut court-circuiter transitoirement la cascade de signalisation MAVS. Cette cascade peut être déclenchée par dsRNA et conduit à la production d’interféron et de cytokines pro-inflammatoires. Ainsi, la présence du SSHHPS peut être utile pour prédire quelles espèces ont des systèmes de défense contre des virus spécifiques du groupe IV.
Dans les virus du groupe IV, on pense que les mécanismes d’antagonisme de l’IFN se multiplient redondants25. Le clivage protéique hôte peut être transitoire pendant l’infection et les concentrations peuvent se rétablir avec le temps. Nous avons constaté dans les cellules que les produits de clivage TRIM14 pouvaient être détectés très tôt après la transfection (6 h) avec un plasmide codant la protéase (promotrice de cytomégalovirus). Cependant, à de plus longues périodes, les produits de clivage n’ont pas été détectés. Dans les cellules infectées par le virus, la cinétique était différente et les produits de clivage pouvaient être détectés entre 6-48 h6. D’autres ont rapporté l’apparition de produits de clivage de protéine d’hôte dès 3-6 h après l’infection9,11.
L’activité protéolytique dans les cellules est souvent difficile à attraper; les produits de clivage peuvent varier dans leur solubilité, concentration, stabilité, et durée de vie. Dans les analyses cellulaires, on ne peut pas supposer que les produits de clivage s’accumuleront dans une cellule ou que les intensités de la bande de protéines coupées et non coupées montreront des augmentations et des diminutions compensatoires, car la protéine coupée peut être dégradée très rapidement et ne peut pas être détectable dans une tache occidentale à un poids moléculaire prévu (MW) (p. ex., la région contenant l’épitope pourrait être coupée par d’autres protéases hôtes). Si le substrat de la protéase virale est une protéine de réponse immunitaire innée, sa concentration peut varier pendant l’infection. Par exemple, certaines protéines de réponse immunitaire innées sont présentes avant l’infection virale et sont induites davantage par l’interféron26. La concentration de la protéine cible peut donc fluctuer pendant l’infection et la comparaison des lysates cellulaires non infectés par rapport aux cellules infectées peut être difficile à interpréter. En outre, toutes les cellules peuvent ne pas être uniformément transfectées ou infectées. Les essais de protéase in vitro utilisant des protéines purifiées de E. coli d’autre part ont moins de variables pour lesquelles contrôler et de telles analyses peuvent être faites en utilisant SDS-PAGE plutôt que des immunoblots. Les protéases contaminantes peuvent être inhibées dans les premières étapes de la purification des protéines du substrat CFP/YFP, et les protéases virales mutées peuvent être purifiées et testées comme témoins pour déterminer si le clivage est dû à la protéase virale ou à une protéase bactérienne contaminante.
Une limitation des essais de protéase in vitro est qu’ils n’ont pas la complexité d’une cellule de mammifères. Pour qu’une enzyme coupe son substrat, les deux doivent être co-localisés. Les protéases virales du groupe IV diffèrent dans la structure et la localisation. Par exemple, la protéase ZIKV est incorporée dans la membrane du réticulum endoplasmique (ER) et fait face au cytosol, tandis que la protéase VEEV nsP2 est une protéine soluble dans le cytoplasme et le noyau27. Certaines des séquences de site de clivage trouvées dans l’analyse de ZIKV SSHHPS étaient dans des peptides de signal suggérant que le clivage pourrait se produire co-traductionnellement pour quelques cibles. Ainsi, l’emplacement de la protéase et le substrat dans la cellule doivent également être pris en compte dans ces analyses.
Les tests cellulaires peuvent être utiles pour établir un rôle pour la protéine hôte identifiée dans l’infection. Les méthodes qui visent à arrêter le clivage de protéase virale des protéines hôtes telles que l’ajout d’un inhibiteur de la protéase6 ou une mutation dans la cible hôte16 peuvent être utilisés pour examiner leurs effets sur la réplication virale. La surexpression de la protéine ciblée peut également affecter la réplication virale28. Les essais de plaque ou d’autres méthodes peuvent être utilisés pour quantifier la réplication virale.
La destruction spécifique à la séquence d’une protéine ou d’un acide nucléique guidée par une séquence étrangère n’est observée que dans quelques cas en biologie. Les mécanismes indiqués à la figure 1 sont des mécanismes défensifs qui protègent un hôte contre un virus ou un virus d’un hôte.
En utilisant des méthodes bioinformatiques, nous pouvons identifier les cibles qui sont détruites par ces systèmes. Dans nos analyses des séquences de SSHHP, nous avons découvert que beaucoup d’entre eux pourraient être trouvés dans les protéines nécessaires pour générer des réponses immunitaires innées. Certains avaient des rôles évidents tels que MAVS et TRIF (adapton adaptateur-contenant le domaine TIR-induisant l’interféron-MD), tandis que d’autres étaient liés à l’immunité bien que des mécanismes plus complexes (par exemple, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. L’information cible stockée dans la séquence SSHHP a le potentiel d’identifier les voies qui ont des effets antiviraux contre ces virus. Les réponses antivirales in vivo sont souvent spécifiques au virus26,43. Par exemple, les sous-ensembles de protéines TRIM ont des effets antiviraux sur différents virus43,44,45, certains sont des facteurs de restriction virale (par exemple, le VIH et TRIM5). La spécificité des protéines TRIM (70 ont été identifiées) est encore à l’étude44,45. L’information contenue dans le SSHHPS peut contribuer à notre compréhension de la façon dont ces virus échappent aux réponses immunitaires innées. D’autres modèles et corrélations peuvent être découverts au fur et à mesure que l’on examine davantage le SSHHPS.
Des différences propres aux espèces étaient évidentes dans nos analyses (Figure 2, Figure 10). Ces virus sont connus pour affecter certaines espèces plus que d’autres. Des informations sur la portée de l’hôte, la susceptibilité de l’hôte et les défenses d’hôte peuvent être présentes au sein du SSHHPS. Par exemple, l’équidé, l’espèce la plus sensible aux virus de l’encéphalite équine, n’avait pas la région de TRIM14 humain qui a été coupée transitoirement par la protéase VEEV nsP2. Les humains meurent rarement des infections de VEEV mais peuvent être infectés24. La protéine humaine TRIM14 portait une séquence de clivage de protéase nsP26. La présence du site de clivage suggère que les humains ont un mécanisme de défense contre ces virus. On a pensé que les oiseaux étaient des réservoirs potentiels de ces virus46. La séquence SSHHP correspondante dans la protéine TRIM14 des poulets différait des séquences trouvées chez l’homme et d’autres espèces. Des différences subtiles comme celles-ci peuvent rendre une protéine hôte cible oncleavable ou plus facilement clivée. Aguirre et coll.16 ont montré qu’une protéine STRING mutée oncleavable induit des niveaux plus élevés d’IFN après l’infection par le virus de la dengue et que les souris portent naturellement une version de STING qui n’est pas coupée par la protéase dengue ns2B3. La protéine murine STING n’a pas été coupée par la protéase ZIKV47. Dans notre analyse SSHHPS, nous avons également observé des différences dans les séquences du site de clivage de protéase ZIKV lorsque nous avons comparé les protéines humaines avec celles des rongeurs6 (Figure 10D). La reproduction des clivages protéolytiques spécifiques aux espèces des protéines hôtes peut être importante dans les modèles animaux utilisés pour les virus du groupe IV. L’inhibition du clivage protéique hôte a également des implications en ce qui concerne le développement des inhibiteurs de la protéase du groupe IV. Dans notre publication précédente, nous avons montré que nous pouvions inhiber trim14 clivage par la protéase VEEV nsP2 en utilisant CA074 ester méthyle6. Ce résultat suggère que les inhibiteurs de petite molécule de ces protéases puissent moduler les réponses immunitaires innées qui sont capables de supprimer l’infection6,31.
La variation génétique au sein d’une espèce a également le potentiel de produire des différences dans le clivage protéolytique. Les différences subtiles dans l’utilisation de codon pourraient affecter la pause ribosome48. Étant donné que certaines protéases virales du groupe IV sont intégrées dans la membrane des urgences, les différences dans ces pauses pourraient affecter le clivage d’une cible si le clivage se produit de façon co-traduite. Certains des sites de clivage que nous avons identifiés se trouvaient dans des séquences de peptides de signal prévues (p. ex., SFRP1) tandis que d’autres étaient internes.
L’analyse SSHHPS peut produire des informations qui diffèrent des autres méthodes d’analyse des protéines hôtes. L’analyse Du SSHHPS était peu coûteuse et facile à employer. L’utilisation d’un système d’expression bactérienne a permis de tester des segments courts (25 acides aminés) de séquences de mammifères sans l’utilisation de la culture cellulaire des mammifères. Nous avons constaté que les substrats CFP-YFP étaient capables de tolérer toutes les séquences de protéines humaines testées; cependant, les rendements variaient. Dans des essais semblables, des substrats contenant des séquences de protéine humaine aussi longtemps que 63 acides aminés ont été avec succès exprimés, purifiés, et utilisés pour des analyses cinétiques et le criblage d’inhibiteur49,50,51. Étant donné que seules de petites quantités du substrat sont nécessaires pour l’analyse discontinue, un grand nombre de cibles peuvent être explorées. L’un des avantages du système est que les substrats CFP/YFP peuvent être utilisés pour des analyses SDS-PAGE et pour des analyses cinétiques plus élaborées (c.-à-d., IC50, Ki, Km, Vmax). Pour la découverte de médicaments, les composés inhibiteurs peuvent produire des artefacts dans des analyses fluorescentes. Ainsi, l’essai discontinu en combinaison avec un essai continu permet de confirmer le clivage ou l’inhibition du clivage. Les échantillons pour l’analyse discontinu SDS-PAGE peuvent être prélevés directement sur les plaques de 96 puits. Les substrats CFP/FpJ ont été utilisés pour le dépistage des bibliothèques composées52. Cependant, des analyses supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si un substrat convient au dépistage à haut débit, comme le calcul d’un facteur Z53.
L’un des défis de la conception d’un substrat est d’identifier la région autour du lien scissile qui est lié et reconnu par la protéase. Dans les exemples présentés ici, nous avons commencé avec 12 séquences de résidus qui ont été centrées autour du lien scissile. Après avoir analysé les alignements de séquence des sites de clivage homologie aux résidus N-terminal du lien scissile a été trouvé pour la protéase VEEV, tandis que pour l’homologie de protéase ZIKV à plusieurs des résidus C-terminal a été trouvé. Un modèle in silico du substrat amarré peut être utilisé pour concevoir des expériences de mutagénèse dirigées par le site qui sondent les sites de liaison du substrat. Puisque le substrat et les séquences d’enzymes sont sur des plasmides, l’un ou l’autre peut être muté pour tester les modèles en silico ou les tolérances de sous-site. Cela peut être avantageux si une structure cristalline du substrat lié n’est pas disponible.
L’analyse du SSHHPS peut également fournir de nouvelles informations sur les mécanismes par lesquels les phénotypes induits par le virus sont produits par des enzymes virales. Une des cibles ZIKV, SFRP1, fait partie de la voie de signalisation Wnt et a des rôles dans le développement du cerveau et des yeux et dans les réponses immunitaires36,37,54,55,56,57. Nous avons constaté que les autres séquences protéiques qui pourraient être coupées par la protéase ZIKV ns2B/ns3 étaient également dans les protéines impliquées dans le développement du cerveau et des yeux; des anomalies dans les deux ont été observées dans le syndrome congénital de Zika et sont vraisemblablement pour faire partie du phénotype58virus-induit.
La prévisibilité des interactions hôte-pathogène pourrait être exploitée pour une variété d’applications : thérapies virales oncolytiques spécifiques à la cible; la réduction du risque des vaccins contre les virus vivants; le raffinement, la prédiction ou la sélection des modèles animaux; prédiction de la portée ou de la susceptibilité de l’hôte; prévision des événements zoonotiques; et la prédiction des défenses d’hôte. Étant donné que les méthodes décrites sont basées sur des séquences, elles peuvent être d’une valeur à intégrer dans le logiciel à l’avenir.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par les numéros de projet CB-SEED-SEED09-2-0061 et CBCall4-CBM-05-2-0019, et en partie par le programme de recherche intra-muros/extra-muros des fonds de base du NCATS, des NIH (XH) et du Naval Research Laboratory.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |