हम वायरल पॉलीप्रोटीन में एम्बेडेड समरूप मेजबान-रोगजनक प्रोटीन दृश्यों (एसएचएचपीएस) के छोटे हिस्सों की पहचान करने के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल पेश करते हैं। SSHHPS वायरल proteases द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे है और कई समूह चतुर्थ वायरस द्वारा विशिष्ट मेजबान प्रोटीन के लक्षित विनाश प्रत्यक्ष ।
अल्फावायरल एंजाइमों को एक पॉलीपेप्टाइड में संश्लेषित किया जाता है। गैर संरचनात्मक पॉलीप्रोटीन (एनएसपी) को वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक सक्रिय एंजाइमों का उत्पादन करने के लिए अपने nsP2 साइस्टीन प्रोटीज द्वारा संसाधित किया जाता है। वायरल प्रोटीज़ अत्यधिक विशिष्ट हैं और संरक्षित दरार साइट आकृति दृश्यों (~ 6-8 अमीनो एसिड) को पहचानते हैं। कई ग्रुप IV वायरस में, एनएसपी प्रोटीज (एस) क्लीवेज साइट आकृति दृश्यों को विशिष्ट मेजबान प्रोटीन में पाया जा सकता है जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को उत्पन्न करने में शामिल होते हैं और कुछ मामलों में, लक्षित प्रोटीन वायरस-प्रेरित फेनोटाइप से जुड़े होते दिखाई देते हैं। ये वायरस मेजबान प्रोटीन के लक्षित विनाश के लिए समरूप मेजबान-रोगजनक प्रोटीन दृश्यों (SSHHPS) के छोटे हिस्सों का उपयोग करते हैं। SSHHPS की पहचान करने के लिए वायरल प्रोटीज़ दरार साइट आकृति दृश्यों विस्फोट में इनपुट किया जा सकता है और मेजबान जीनोम (एस) खोजा जा सकता है । दरार शुरू में शुद्ध nsP वायरल प्रोटीज़ और फ्लोरेसेंस अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) ई. कोलाईमें किए गए सब्सट्रेट्स का उपयोग करके परीक्षण किया जा सकता है । FRET सब्सट्रेट्स में सियान और येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन और क्लीवेज साइट सीक्वेंस (सीएफपी-सीक्वेंस-वाईएफपी) होते हैं। इस प्रोटीज़ परख का उपयोग प्लेट रीडर में या एसडी-पेज जैल में लगातार किया जा सकता है। सब्सट्रेट चयन और म्यूटाजेनेसिस अध्ययन ों का मार्गदर्शन करने के लिए सिलिको में बाउंड पेप्टाइड सब्सट्रेट्स के मॉडल उत्पन्न किए जा सकते हैं। प्रोटीज़ अवरोधकों की पहचान करने के लिए सीएफपी/वाईएफपी सब्सट्रेट्स का भी उपयोग किया गया है । इन इन विट्रो और सिलिको तरीकों में सेल आधारित परखके साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है निर्धारित करने के लिए अगर लक्षित मेजबान प्रोटीन वायरल प्रतिकृति को प्रभावित करता है ।
वायरस से मेजबान, या वायरस की मेजबानी के लिए क्षैतिज जीन हस्तांतरण के सबूत,जीनोम कीएक किस्म में पाया जा सकता है1,2,3,4। वायरल एंडोजेनाइजेशन के उदाहरण बैक्टीरियल होस्ट जीनोम4में पाए जाने वाले CRISPR स्पेसर सीक्वेंस हैं । हाल ही में, हमें मेजबान प्रोटीन दृश्यों के सबूत मिले हैं जो (+) ssRNA समूह IV वायरस के गैर संरचनात्मक पॉलीप्रोटीन में एम्बेडेड हैं। वायरल जीनोम के कोडिंग क्षेत्रों के भीतर इन दृश्यों को पीढ़ी-पीढ़ी प्रचारित किया जा सकता है। इस वायरस और मेजबान5,6में समरूप मेजबान-रोगजनक प्रोटीन दृश्यों (एसएचएचपीएस) के छोटे हिस्सपाए जाते हैं । SSHHPS संरक्षित दरार साइट आकृति दृश्यों वायरल proteases कि विशिष्ट मेजबान प्रोटीन के लिए homology है द्वारा मांयता प्राप्त कर रहे हैं । ये दृश्य विशिष्ट मेजबान प्रोटीन के विनाश को निर्देशित करते हैं।
हमारे पिछले प्रकाशन6में, हमने उन सभी मेजबान प्रोटीनों की एक सूची संकलित की जिन्हें वायरल प्रोटीज़ द्वारा लक्षित किया गया था और पाया गया कि लक्ष्यों की सूची गैर-यादृच्छिक(तालिका 1)थी। दो रुझान स्पष्ट थे । सबसे पहले, वायरल प्रोटीज़ के बहुमत है कि मेजबान प्रोटीन में कटौती समूह चतुर्थ वायरस के थे (25 मामलों में से 24 समूह चतुर्थ वायरल proteases शामिल है), और एक प्रोटीज़ (+) ssRNA समूह छठी रेट्रोवायरस (एचआईवी, मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस)7के थे । दूसरा, मेजबान प्रोटीन लक्ष्य वायरल proteases द्वारा काटा जा रहा है आम तौर पर सहज प्रतिरक्षा सुझाव है कि दरार मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं विरोधी करने का इरादा थे पैदा करने में शामिल थे । वायरल प्रोटीज़ द्वारा लक्षित मेजबान प्रोटीन का आधा सिग्नलिंग कैस्केड के घटक ों को जाना जाता था जो इंटरफेरॉन (आईएफएन) और भड़काऊ साइटोकिन्स(तालिका 1)उत्पन्न करते थे। अन्य लोग मेजबान सेल ट्रांसक्रिप्शन8,9,10 या अनुवाद11में शामिल थे । दिलचस्प बात यहहै कि श्माकोव एट अल 4 ने दिखाया है कि कई CRISPR प्रोटोस्पेसर दृश्य प्लाज्मिड कंजुगन या प्रतिकृति4में शामिल जीन के अनुरूप हैं।
ग्रुप IV में अन्य लोगों के अलावा, फ्लेविरिडी, पिकोरनेविडी, कोरोनाविडी, कैल्सिविरिडी और टोगाविरिडीशामिल हैं। कई नए और उभरते रोगजनक जीका वायरस (जीकेकेवी), वेस्ट नील (WNV), चिकनगुनिया (चिकेवी), गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम वायरस (सार्स) और मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम वायरस (मर्स) जैसे ग्रुप IV के हैं । (+) ssRNA जीनोम अनिवार्य रूप से mRNA का एक टुकड़ा है । जीनोम प्रतिकृति के लिए आवश्यक एंजाइमों का उत्पादन करने के लिए, (+) ssRNA जीनोम पहले अनुवाद किया जाना चाहिए । अल्फावायरस और अन्य समूह चतुर्थ वायरस में, प्रतिकृति के लिए आवश्यक एंजाइमों का उत्पादन एक पॉलीप्रोटीन (यानी, वीईवी के लिए nsP1234) में किया जाता है। एनएसपी 2 प्रोटीज द्वारा सक्रिय एंजाइम12 (चित्रा 1)का उत्पादन करने के लिए गैर संरचनात्मक पॉलीप्रोटीन (एनएसपी) को प्रोटेओलिटिक प्रोसेस (एनएसपी1234 एनएसपी1, एनएसपी2, एनएसपी3, एनएसपी4) द्वारा संसाधित किया जाता है । एनएसपी2 प्रोटीज़ द्वारा पॉलीप्रोटीन का दरार वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक है; यह nsP2 प्रोटीज13,14के सक्रिय साइट साइस्टीन के हटाने और साइट निर्देशित म्यूटेजेनेसिस द्वारा प्रदर्शन किया गया है . विशेष रूप से, वायरल प्रोटीन का अनुवाद जीनोम प्रतिकृति घटनाओं से पहले होता है। उदाहरण के लिए, nsP4 में आरएनए-निर्भर आरएनए बहुलक (+) ssRNA जीनोम को दोहराने के लिए आवश्यक है। जीनोम प्रतिकृति dsRNA मध्यवर्ती का उत्पादन कर सकते हैं; ये मध्यवर्ती मेजबान की जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकते हैं। इस प्रकार, ये वायरस अपने प्रभावों को दबाने के लिए संक्रमण की शुरुआत में जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रोटीन की मेजबानी कर सकते हैं15,16,17।
मुंह में डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के स्तर पर हो सकता है। क्या चित्रा 1 में दिखाया मुंह बंद तंत्र में से प्रत्येक के लिए आम है कि कम विदेशी डीएनए, आरएनए, या प्रोटीन दृश्यों विशिष्ट लक्ष्यों के विनाश का मार्गदर्शन करने के लिए अपने समारोह विरोधी उपयोग कर रहे हैं । मुंह बंद तंत्र तीन अलग-अलग भाषाओं में लिखे गए कार्यक्रमों को “खोज और हटाने” के अनुरूप हैं। लघु दरार साइट अनुक्रम “कीवर्ड” के अनुरूप है। प्रत्येक कार्यक्रम में एक एंजाइम होता है जो छोटे अनुक्रम (“कीवर्ड”) के बीच मैच को पहचानता है और “फ़ाइल” में एक शब्द जिसे हटाया जाना है। एक बार मैच मिलने के बाद, एंजाइम बड़ा लक्ष्य अनुक्रम (“हटाता है”) काटता है। चित्रा 1 में दिखाए गए तीन तंत्र ों का उपयोग वायरस से मेजबान की रक्षा करने या मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली से वायरस की रक्षा के लिए किया जाता है।
वायरल प्रोटीज़ ~ 2-11 अमीनो एसिड के बीच लघु दरार साइट आकृति दृश्यों को पहचानते हैं; न्यूक्लियोटाइड्स में, यह 6-33 ठिकानों के अनुरूप होगा। तुलना के लिए, CRISPR स्पेसर दृश्य ~ 26-72 न्यूक्लियोटाइड्स हैं और आरएनएआई ~ 20-22 न्यूक्लियोटाइड्स18,19हैं। जबकि ये दृश्य अपेक्षाकृत कम हैं, उन्हें विशेष रूप से पहचाना जा सकता है। अमीनो एसिड की उच्च विविधता को देखते हुए, एक यादृच्छिक दरार घटना की संभावना 6-8 अमीनो एसिड या उससे अधिक समय के प्रोटीन दृश्यों को पहचानने वाले वायरल प्रोटीज़ के लिए अपेक्षाकृत कम है। मेजबान प्रोटीन में SSHHPS की भविष्यवाणी काफी हद तक वायरल प्रोटीज की विशिष्टता पर निर्भर करेगा की जांच की जा रही है । यदि प्रोटीज़ सख्त अनुक्रम विशिष्टता आवश्यकताओं है एक दरार साइट अनुक्रम खोजने का मौका 1/206 = 1 में 64 मिलियन या 1/208 = 1 में 25.6 अरब है; हालांकि, अधिकांश प्रोटीज़ में परिवर्तनीय उपसाइट सहिष्णुता होती है (उदाहरण के लिए, आर या के को S1 साइट पर सहन किया जा सकता है)। नतीजतन, मेजबान बनाम वायरस में पाए जाने वाले दृश्यों के बीच अनुक्रम पहचान के लिए कोई आवश्यकता नहीं है। वायरल प्रोटीज़ के लिए जिनमें लूजर अनुक्रम आवश्यकताएं हैं (जैसे पिकोरनेविडी से संबंधित) एक मेजबान प्रोटीन में दरार साइट खोजने की संभावना अधिक हो सकती है। तालिका 1 में प्रविष्टियों में से कई पिकोरनेविडे परिवार से हैं ।
Schechter और बर्जर नोटेशन20 आमतौर पर एक प्रोटीज़ सब्सट्रेट और उपसाइटों में अवशेषों का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसके लिए वे बांधते हैं, हम इस नोटेशन का उपयोग करते हैं। सब्सट्रेट में अवशेष जो कैंची बांड के एन-टर्मिनल हैं, को P3-P2-P1 के रूप में चिह्नित किया गया है जबकि जो सी-टर्मिनल हैं, उन्हें P1′-P2′-P3 ‘ के रूप में चिह्नित किया गया है। इन अमीनो एसिड अवशेषों को बांधने वाले प्रोटीज़ में संबंधित उपसाइटक्रमशः S3-S2-S1 और S1′-S2’-S3 ‘ हैं।
यह निर्धारित करने के लिए कि किस मेजबान प्रोटीन को लक्षित किया जा रहा है, हम वायरल पॉलीप्रोटीन क्लीवेज साइटों में एसएसएचपीएस की पहचान कर सकते हैं और उनमें शामिल मेजबान प्रोटीन की खोज कर सकते हैं। इसके साथ, हम ज्ञात वायरल प्रोटीज़ दरार साइट दृश्यों का उपयोग करएसएस की पहचान करने के लिए प्रक्रियाओं की रूपरेखा तैयार करते हैं। जैव सूचना के तरीकों, प्रोटीज़ परख, और सिलिको तरीकों में वर्णित सेल आधारित परख के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाना है ।
वायरल प्रोटीज़ द्वारा लक्षित मेजबान प्रोटीन के अनुक्रम संरेखण इन लघु दरार साइट दृश्यों के भीतर प्रजातियों-विशिष्ट मतभेदों का पता चला है । उदाहरण के लिए, वेनेजुएला के घोड़े इंसेफेलाइटिस वायरस (VEEV) nsP2 प्रोटीज़ मानव TRIM14, एक त्रिपक्षीय आकृति (TRIM) प्रोटीन6में कटौती करने के लिए पाया गया था । कुछ ट्रिम प्रोटीन वायरल प्रतिबंध कारक हैं (उदाहरण के लिए, TRIM5α21),अधिकांश को सर्वव्यापी E3 लिगैस माना जाता है। TRIM14 एक अंगूठी (वास्तव में दिलचस्प नए जीन) डोमेन का अभाव है और एक E3 ligase22नहीं सोचा है । TRIM14 को माइटोकॉन्ड्रियल एंटीवायरल सिग्नलोसोम (एमएवीएस)22में एडाप्टर बनने का प्रस्ताव किया गया है, लेकिन अन्य एंटीवायरल कार्य हो सकते हैं23। विभिन्न प्रजातियों से TRIM14 दृश्यों के संरेखण से पता चलता है कि घोड़े दरार साइट की कमी है और TRIM14 के एक छोटा संस्करण है कि सी टर्मिनल PRY/SPRY डोमेन याद आ रही है बंदरगाह । इस डोमेन में एक पॉलीयूब्किशन साइट(चित्रा 2)शामिल है। घोड़े में, ये वायरस अत्यधिक घातक (~ 20-80% मृत्यु दर) हैं जबकि मनुष्यों में केवल ~ 1% वीईवी संक्रमण24से मरते हैं। PRY/SPRY डोमेन के दरार क्षणिक रूप से शॉर्ट सर्किट MAVS संकेत झरना हो सकता है । यह झरना dsRNA द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है और इंटरफेरॉन और समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन की ओर जाता है। इस प्रकार, SSHHPS की उपस्थिति यह भविष्यवाणी करने के लिए उपयोगी हो सकती है कि किस प्रजाति में विशिष्ट समूह चतुर्थ वायरस के खिलाफ रक्षा प्रणाली है।
समूह चतुर्थ वायरस में, IFN विरोध तंत्र बेमानी25गुणा माना जाता है । मेजबान प्रोटीन दरार संक्रमण के दौरान क्षणिक हो सकता है और समय के साथ सांद्रता ठीक हो सकती है। हमने कोशिकाओं में पाया कि TRIM14 दरार उत्पादों को एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग (साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर) के साथ ट्रांसफेक्शन (6 एच) के बाद बहुत जल्दी पता लगाया जा सकता है। हालांकि, लंबी अवधि में, दरार उत्पादों का पता नहीं चला। वायरस से संक्रमित कोशिकाओं में, गतिज अलग थे और दरार उत्पादों 6-48 एच6के बीच पता लगाया जा सकता है । अन्य लोगों ने 3-6 घंटे के बाद संक्रमण9,11के रूप में मेजबान प्रोटीन दरार उत्पादों की उपस्थिति की सूचना दी है ।
कोशिकाओं में प्रोटेलिटिक गतिविधि अक्सर पकड़ना मुश्किल होता है; दरार उत्पादों को उनकी घुलनशीलता, एकाग्रता, स्थिरता, और जीवनकाल में भिन्न हो सकते हैं। सेल आधारित परखों में, यह नहीं माना जा सकता है कि दरार उत्पादों को एक सेल में जमा होगा या कि कटौती और अनकट प्रोटीन के बैंड तीव्रता प्रतिपूरक वृद्धि और कम हो जाती है के रूप में कटौती प्रोटीन बहुत जल्दी अपमानित किया जा सकता है और एक उंमीद आणविक वजन (MW) (जैसे, epitope युक्त क्षेत्र अंय मेजबान protease द्वारा क्लीव्ड किया जा सकता है) दिखाई देगा । यदि वायरल प्रोटीज का सब्सट्रेट एक सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रोटीन है, तो संक्रमण के दौरान इसकी एकाग्रता भिन्न हो सकती है। उदाहरण के लिए, वायरल संक्रमण से पहले कुछ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रोटीन मौजूद होते हैं औरइंटरफेरॉन 26द्वारा आगे प्रेरित होते हैं। इसलिए संक्रमण के दौरान लक्ष्य प्रोटीन की एकाग्रता में उतार-चढ़ाव हो सकता है और संक्रमित कोशिका लिये की तुलना व्याख्या करना मुश्किल हो सकता है। इसके अतिरिक्त, सभी कोशिकाओं को समान रूप से ट्रांससंक्रमित या संक्रमित नहीं किया जा सकता है। इन विट्रो प्रोटीज परख ों में दूसरी ओर ई. कोलाई से शुद्ध प्रोटीन का उपयोग कर कम चर है जिसके लिए नियंत्रित करने के लिए और इस तरह के परखों के बजाय इम्यूनोलॉट ्स-पेज का उपयोग किया जा सकता है । दूषित प्रोटीज को सीएफपी/वाईएफपी सब्सट्रेट के प्रोटीन शुद्धिकरण के शुरुआती चरणों में बाधित किया जा सकता है, और उत्परिवर्तित वायरल प्रोटीज़ को शुद्ध किया जा सकता है और नियंत्रण के रूप में परीक्षण किया जा सकता है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि दरार वायरल प्रोटीज़ या दूषित बैक्टीरियल प्रोटीज के कारण है या नहीं ।
इन विट्रो प्रोटीज परखों की एक सीमा यह है कि उनमें स्तनधारी कोशिका की जटिलता की कमी है। एक एंजाइम के लिए अपने सब्सट्रेट में कटौती करने के लिए, दोनों को सह-स्थानीयकृत किया जाना चाहिए। समूह चतुर्थ वायरल प्रोटीज़ संरचना और स्थानीयकरण में भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, ZIKV प्रोटीज एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) झिल्ली में एम्बेडेड है और साइटोसोल का सामना करता है, जबकि वीईवी एनएसपी2 प्रोटीज़ साइटोप्लाज्म और न्यूक्लियस27में घुलनशील प्रोटीन है। ZIKV SSHHPS विश्लेषण में पाया दरार साइट दृश्यों में से कुछ संकेत पेप्टाइड्स में थे सुझाव है कि दरार सह कुछ लक्ष्यों के लिए अनुवाद हो सकता है । इस प्रकार, कोशिका में प्रोटीज़ और सब्सट्रेट के स्थान पर भी इन विश्लेषणों में विचार करने की आवश्यकता है।
कोशिका आधारित परख संक्रमण में पहचाने गए मेजबान प्रोटीन (एस) के लिए एक भूमिका स्थापित करने के लिए मूल्यवान हो सकता है। ऐसे तरीके जिनका उद्देश्य मेजबान प्रोटीन के वायरल प्रोटीज़ क्लीवेज को रोकना है जैसे कि एक प्रोटीज़ अवरोधक6 या मेजबान लक्ष्य16 में उत्परिवर्तन के अलावा वायरल प्रतिकृति पर उनके प्रभावों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। लक्षित प्रोटीन की अति अभिव्यक्ति भी वायरल प्रतिकृति28को प्रभावित कर सकती है । पट्टिका परखया या अन्य तरीकों का उपयोग वायरल प्रतिकृति की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।
एक प्रोटीन या एक विदेशी अनुक्रम द्वारा निर्देशित एक नाभिक एसिड के अनुक्रम विशिष्ट विनाश केवल जीव विज्ञान में कुछ मामलों में देखा जाता है । चित्रा 1 में दिखाए गए तंत्र रक्षात्मक तंत्र हैं जो एक वायरस से मेजबान की रक्षा करते हैं, या मेजबान से वायरस।
बायोइन्फॉर्मेटिक तरीकों का उपयोग करके हम इन प्रणालियों द्वारा नष्ट किए गए लक्ष्यों की पहचान कर सकते हैं। SSHHP दृश्यों के हमारे विश्लेषण में, हमें पता चला कि उनमें से कई प्रोटीन में पाया जा सकता है सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है । कुछ ऐसे MAVS और TRIF (TIR-डोमेन युक्त एडाप्टर-उत्प्रेरण इंटरफेरॉन-ο) के रूप में स्पष्ट भूमिकाएं थीं, जबकि अन्य प्रतिरक्षा से संबंधित थे, हालांकि अधिक जटिल तंत्र (जैसे, हिस्टोन H3, SFRP1, FOXG1)8,9। एसएचएचपी अनुक्रम में संग्रहित लक्षित जानकारी में उन रास्तों की पहचान करने की क्षमता है जिनका इन वायरसों के खिलाफ एंटीवायरल प्रभाव पड़ता है। वीवो में एंटीवायरल प्रतिक्रियाएं अक्सर वायरस विशिष्ट26,43होती हैं । उदाहरण के लिए, ट्रिम प्रोटीन के सबसेट में विभिन्न वायरस43,44,45पर एंटीवायरल प्रभाव पड़ता है, कुछ वायरल प्रतिबंध कारक हैं (जैसे, एचआईवी और TRIM5α)। ट्रिम प्रोटीन (~ 70 की पहचान कर ली गई है) की विशिष्टता अभी भी44,45की जांच की जा रही है। SSHHPS के भीतर जानकारी कैसे इन वायरस सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने के बारे में हमारी समझ में योगदान कर सकते हैं । अन्य पैटर्न और सहसंबंधों का पर्दाफाश किया जा सकता है क्योंकि अधिक एसएचएचपीएस की जांच की जाती है।
हमारे विश्लेषणों में प्रजातियों के विशिष्ट अंतर स्पष्ट थे(चित्र ा 2, चित्रा 10)। ये वायरस दूसरों की तुलना में कुछ प्रजातियों को प्रभावित करने के लिए जाने जाते हैं। मेजबान रेंज, मेजबान संवेदनशीलता और मेजबान सुरक्षा के बारे में जानकारी SSHHPS के भीतर मौजूद हो सकती है। उदाहरण के लिए, घोड़े, सबसे अतिसंवेदनशील प्रजातियों के लिए इंसेफेलाइटिस वायरस घोड़े, मानव TRIM14 के क्षेत्र है कि क्षणिक VEEV nsP2 प्रोटीज़ द्वारा काटा गया था कमी रह गई थी । मनुष्य शायद ही कभी VEEV संक्रमण से मर जाते हैं, लेकिन24संक्रमित किया जा सकता है । मानव TRIM14 प्रोटीन एक nsP2 प्रोटीज़ दरार अनुक्रम6किया । दरार साइट की उपस्थिति का सुझाव है कि मनुष्य इन वायरस के खिलाफ एक रक्षा तंत्र है । पक्षियों को इन वायरसों के संभावित जलाशय माना गयाहै। मुर्गियों से TRIM14 प्रोटीन में इसी SSHHP अनुक्रम मनुष्यों और अन्य प्रजातियों में पाया दृश्यों से मतभेद । इस तरह के सूक्ष्म मतभेद एक लक्ष्य मेजबान प्रोटीन अंकल या अधिक आसानी से क्लीव्ड कर सकते हैं । Aguirre एट अल16 से पता चला है कि एक चाचा उत्परिवर्तित स्ट्रिंग प्रोटीन डेंगू वायरस संक्रमण के बाद IFN के उच्च स्तर को प्रेरित किया और चूहों स्वाभाविक रूप से डंक का एक संस्करण है कि डेंगू ns2B3 protease द्वारा कटौती नहीं है ले । मिमूत्र स्टिंग प्रोटीन को जीकेवी प्रोटीज़47द्वारा नहीं काटा गया था . हमारे SSHHPS विश्लेषण में, हमने ZIKV प्रोटीज़ क्लीवेज साइट दृश्यों में अंतर भी देखा जब हमने मानव प्रोटीन की तुलना कृंतक6 (चित्रा 10डी)के साथ की। मेजबान प्रोटीन की प्रजातियों-विशिष्ट प्रोटेलियोलिटिक क्लीवेज को पुन: उत्पन्न करना समूह चतुर्थ वायरस के लिए उपयोग किए जाने वाले पशु मॉडलों में महत्वपूर्ण हो सकता है। मेजबान प्रोटीन दरार के अवरोध भी समूह चतुर्थ प्रोटीज़ अवरोधकों के विकास के संबंध में निहितार्थ है । हमारे पिछले प्रकाशन में, हमने दिखाया कि हम CA074 मिथाइल एस्टर6का उपयोग करके VEEV nsP2 प्रोटीज़ द्वारा TRIM14 दरार को बाधित कर सकते हैं। इसपरिणाम से पता चलता है कि इन प्रोटीज़ के छोटे अणु अवरोधक जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को मिलासकते हैं जो संक्रमण को दबाने में सक्षम हैं।
एक प्रजाति के भीतर आनुवंशिक भिन्नता में प्रोटेलिटिक क्लीवेज में अंतर पैदा करने की क्षमता भी होती है। कोडन के उपयोग में सूक्ष्म अंतर राइबोसोम रुके48को प्रभावित कर सकता है . चूंकि कुछ समूह चतुर्थ वायरल प्रोटीज़ ईआर झिल्ली में एम्बेडेड होते हैं, इसलिए इन ठहरावमें अंतर एक लक्ष्य के दरार को प्रभावित कर सकता है यदि दरार सह-अनुवादात्मक रूप से होती है। दरार साइटों है कि हम की पहचान की कुछ भविष्यवाणी संकेत पेप्टाइड दृश्यों में थे (जैसे, SFRP1) जबकि अंय आंतरिक थे ।
SSHHPS विश्लेषण ऐसी जानकारी का उत्पादन कर सकता है जो मेजबान प्रोटीन विश्लेषण के अन्य तरीकों से अलग है। SSHHPS विश्लेषण सस्ती और रोजगार के लिए आसान था । एक जीवाणु अभिव्यक्ति प्रणाली के उपयोग ने स्तनधारी कोशिका संस्कृति के उपयोग के बिना स्तनधारी दृश्यों के छोटे खंडों (~ 25 अमीनो एसिड) के परीक्षण की अनुमति दी। हमने पाया कि सीएफपी-वाईएफपी सब्सट्रेट्स सभी परीक्षण किए गए मानव प्रोटीन दृश्यों को बर्दाश्त करने में सक्षम थे; हालांकि, पैदावार विविध। इसी तरह के परखों में, मानव प्रोटीन दृश्यों युक्त सब्सट्रेट्स जब तक 63 अमीनो एसिड सफलतापूर्वक व्यक्त किए गए, शुद्ध, और गतिज विश्लेषण और अवरोधक स्क्रीनिंग49,50,51के लिए उपयोग किया गया. चूंकि असतत परख के लिए केवल थोड़ी मात्रा में सब्सट्रेट की जरूरत होती है, इसलिए बड़ी संख्या में लक्ष्यों का पता लगाया जा सकता है । प्रणाली का एक लाभ यह है कि सीएफपी/वाईएफपी सब्सट्रेट्स का उपयोग एसडीएस-पेज विश्लेषणों के लिए और अधिक विस्तृत गतिज विश्लेषणों (यानी आईसी50,केआई,केएम,वीमैक्स)के लिए किया जा सकता है। दवा की खोज के लिए, निरोधात्मक यौगिक फ्लोरोसेंट चढ़ाई में कलाकृतियों का उत्पादन कर सकते हैं । इस प्रकार, एक सतत परख के साथ संयोजन में असतत परख एक दरार या दरार के निषेध की पुष्टि करने के लिए अनुमति देता है । असतत एसडीएस-पेज परख के लिए नमूने सीधे ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में से लिए जा सकते हैं । कंपाउंड लाइब्रेरी स्क्रीनिंग५२के लिए सीएफपी/वाईएफपी सब्सट्रेट्स का इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, अतिरिक्त विश्लेषण ों के लिए निर्धारित करने के लिए आवश्यक है कि क्या एक सब्सट्रेट उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है जैसे कि जेड-फैक्टर53की गणना।
एक सब्सट्रेट डिजाइन करने में एक चुनौती कैंची बांड है कि बाध्य है और प्रोटीज़ से मांयता प्राप्त है चारों ओर क्षेत्र की पहचान है । यहां दिखाए गए उदाहरणों में, हमने 12 अवशेष दृश्यों के साथ शुरुआत की जो कैंची बांड के चारों ओर केंद्रित थे। स्क्रूटनी साइटों होमोलॉजी के अवशेषों के अनुक्रम संरेखण का विश्लेषण करने के बाद कैंची बांड के एन-टर्मिनल वीईवी प्रोटीज़ के लिए पाया गया था, जबकि जीकेवी के लिए कई सी-टर्मिनल अवशेषों को होमोलॉजी का रूप पाया गया था। डॉक्ड सब्सट्रेट के सिलिको मॉडल में साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है जो सब्सट्रेट की बाध्यकारी साइटों की जांच करते हैं। चूंकि सब्सट्रेट और एंजाइम दृश्य प्लाज्मिड पर हैं, या तो सिलिको मॉडल या सबसाइट सहिष्णुता में परीक्षण करने के लिए उत्परिवर्तित किया जा सकता है। यदि बाध्य सब्सट्रेट (एस) की क्रिस्टल संरचना उपलब्ध नहीं है तो यह लाभप्रद हो सकता है।
SSHHPS विश्लेषण भी तंत्र है जिसके द्वारा वायरस प्रेरित फेनोटाइप वायरल एंजाइमों द्वारा उत्पादित कर रहे है के बारे में नई जानकारी उपज हो सकता है । ZIKV लक्ष्यों में से एक, SFRP1, WNt सिग्नलिंग मार्ग का हिस्सा है और मस्तिष्क और आंख दोनों के विकास में भूमिकाएं है और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में36,37,54, 55,56,57. हमने पाया कि ZIKV ns2B/ns3 प्रोटीज़ द्वारा काटे जा सकने वाले अन्य प्रोटीन दृश्य भी मस्तिष्क और नेत्र विकास में शामिल प्रोटीन में थे; दोनों में असामान्यताओं जन्मजात Zika सिंड्रोम में मनाया गया है और वायरस का हिस्सा माना जाता है फेनोटाइप58प्रेरित .
मेजबान रोगजनक बातचीत की पूर्वानुमेयता अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए शोषण किया जा सकता है: लक्ष्य विशिष्ट कैंसरवायरल चिकित्सा; जीका वायरस के टीके को खतरे में डालना; पशु मॉडल का परिष्करण, भविष्यवाणी या चयन; मेजबान-रेंज या संवेदनशीलता की भविष्यवाणी; ज़ूनोटिक घटनाओं की भविष्यवाणी; और मेजबान सुरक्षा की भविष्यवाणी । चूंकि वर्णित विधियां अनुक्रम-आधारित हैं, इसलिए भविष्य में सॉफ्टवेयर में शामिल करने के लिए वे मूल्य के हो सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को रक्षा खतरा न्यूनीकरण एजेंसी (DTRA) परियोजना संख्या सीबी-बीज-SEED09-2-0061 और CBCall4-CBM-05-2-0019 द्वारा समर्थित किया गया था, और भाग में इंट्राम्यूरल/NCATS, NIH (XH) और नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला आधार कोष के Extramural अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा ।
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |