Vi presentiamo un protocollo generale per l’identificazione di brevi distese di sequenze proteiche omologhe ospiti-patogenenze (SSHHPS) incorporate nella poliproteina virale. Gli SSHHPS sono riconosciuti dalle proteasi virali e dirigono la distruzione mirata di specifiche proteine ospiti da parte di diversi virus del Gruppo IV.
Gli enzimi alfavirali sono sintetizzati in un singolo polipeptide. La poliproteina non strutturale (NSP) viene elaborata con la proteasi cisteina di nsP2 per produrre enzimi attivi essenziali per la replicazione virale. Le proteasi virali sono molto specifiche e riconoscono le sequenze di motivi di scissione conservate (6-8 aminoacidi). In diversi virus di Gruppo IV, le sequenze di motivi di scissione della proteasi nsP possono essere trovate in specifiche proteine ospiti coinvolte nella generazione delle risposte immunitarie innate e, in alcuni casi, le proteine mirate sembrano essere collegate al fenotipo indotto dal virus. Questi virus utilizzano brevi distese di sequenze omologhe di proteine omologhe ospiti-patogeni (SSHHPS) per la distruzione mirata delle proteine ospiti. Per identificare Gli SSHHPS, le sequenze di motivi del sito della proteasi virale possono essere inserite in BLAST e i genomi ospiti possono essere cercati. Cleavage inizialmente può essere testato utilizzando la proteasi virale nsP purificata e il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) substrati realizzati in E. coli. I substrati FRET contengono proteine fluorescenti ciano e gialle e la sequenza del sito di scissione (CFP-sequence-YFP). Questo saggio proteasi può essere utilizzato continuamente in un lettore di lastre o discontinuo in gel SDS-PAGE. I modelli dei substrati peptidi legati possono essere generati in silico per guidare la selezione del substrato e gli studi di mutagenesi. Anche i substrati CFP/YFP sono stati utilizzati per identificare gli inibitori della proteasi. Questi metodi in vitro e in silico possono essere utilizzati in combinazione con saggi basati sulle cellule per determinare se la proteina ospite mirata influisce sulla replicazione virale.
Le prove di trasferimento genico orizzontale dal virus all’ospite, o host a virus, possono essere trovate in una varietà di genomi1,2,3,4. Esempi di endogenizzazione virale sono le sequenze distanziali CRISPR trovate nei genomi batterici ospiti4. Recentemente, abbiamo trovato prove di sequenze proteiche ospiti incorporate nelle poliproteine non strutturali dei virus del Gruppo IV di ssRNA. Queste sequenze all’interno delle regioni di codifica del genoma virale possono essere propagate generazionalmente. I brevi tratti di sequenze proteiche omologhe ospiti-patogeni (SSHHPS) si trovano nel virus e nell’host5,6. SSHHPS sono le sequenze di motivo sito di scissione conservate riconosciute dalle proteasi virali che hanno l’omologia di specifiche proteine ospiti. Queste sequenze dirigono la distruzione di specifiche proteine ospiti.
Nella nostra precedente pubblicazione6,abbiamo compilato un elenco di tutte le proteine ospiti che sono state prese di mira da proteasi virali e abbiamo scoperto che l’elenco degli obiettivi non era casuale (Tabella 1). Due tendenze erano evidenti. In primo luogo, la maggior parte delle proteasi virali che tagliavano le proteine ospiti apparteneva ai virus del Gruppo IV (24 dei 25 casi coinvolti proteasi virali di gruppo IV), e una proteasi apparteneva ai retrovirus del gruppo VI (HIV, virus dell’immunodeficienza umana)7. In secondo luogo, gli obiettivi proteici ospiti tagliati dalle proteasi virali sono stati generalmente coinvolti nella generazione di risposte immunitarie innate suggerendo che le scissioni erano destinate ad antagonizzare le risposte immunitarie dell’ospite. La metà delle proteine ospiti prese di mira dalle proteasi virali erano componenti noti di cascate di segnalazione che generano interferone (IFN) e citochine infiammatorie (Tabella 1). Altri sono stati coinvolti nella trascrizione delle cellule ospiti8,9,10 o traduzione11. È interessante notare che Shmakov et al.4 hanno dimostrato che molte sequenze di protostring rCRISP corrispondono ai geni coinvolti nella coniugazione o replicazione plasmida4.
Il Gruppo IV comprende, tra gli altri, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae e Togaviridae. Diversi patogeni nuovi ed emergenti appartengono al Gruppo IV, come il virus del virus zika , il Nilo occidentale (WNV), il Chikungunya (CHIKV), il virus della sindrome respiratoria acuta grave (SARS) e il virus della sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS). Il genoma dello ssRNA è essenzialmente un pezzo di mRNA. Per produrre gli enzimi necessari per la replicazione del genoma, il genoma dello ssRNA deve prima essere tradotto. Negli alfavirus e in altri virus di Gruppo IV, gli enzimi necessari per la replicazione sono prodotti in un unico polibio (ad esempio, nsP1234 per VEEV). La poliproteina non strutturale (nsP) viene elaborata proteolicamente (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) dalla proteasi nsP2 per produrre enzimi attivi12 (Figura 1). La cleavage della poliproteina da parte della proteasi nsP2 è essenziale per la replicazione virale; questo è stato dimostrato dalla cancellazione e dalla mutagenesi diretta al sito del sito attivo cisteina della proteasi nsP213,14. In particolare, la traduzione delle proteine virali precede gli eventi di replicazione del genoma. Ad esempio, nsP4 contiene la polimerasi dell’RNA dipendente dall’RNA necessaria per replicare il genoma dello ssRNA. La replicazione del genoma può produrre intermedi dsRNA; questi intermedi possono innescare le risposte immunitarie innate dell’ospite. Così, questi virus possono fendere ospite proteine di risposta immunitaria innata precoce in infezione al fine di sopprimere i loro effetti15,16,17.
Il silenziamento può verificarsi a livello di DNA, RNA e proteine. Ciò che è comune a ciascuno dei meccanismi di silenziamento illustrati nella Figura 1 è che brevi sequenze di DNA, RNA o proteine estranee vengono utilizzate per guidare la distruzione di obiettivi specifici per antagonizzare la loro funzione. I meccanismi di silenziamento sono analoghi ai programmi di “ricerca ed eliminazione” scritti in tre lingue diverse. La sequenza del sito di scissione breve è analoga a una “parola chiave”. Ogni programma ha un enzima che riconosce la corrispondenza tra la sequenza breve (la “parola chiave”) e una parola nel “file” che deve essere eliminato. Una volta trovata una corrispondenza, l’enzima taglia (“elimina”) la sequenza bersaglio più grande. I tre meccanismi illustrati nella Figura 1 vengono utilizzati per difendere l’ospite dai virus o per difendere un virus dal sistema immunitario di un ospite.
Le proteasi virali riconoscono brevi sequenze di motivi del sito di scissione tra gli amminoacidi da 2 a 11 dollari; nei nucleotidi, questo corrisponderebbe a 6-33 basi. Per fare un confronto, le sequenze distanziali CRISPR sono i nucleotidi da 26 a 72 dollari e gli RNAi sono due-22 nucleotidi18,19. Sebbene queste sequenze siano relativamente brevi, possono essere riconosciute in modo specifico. Data la maggiore diversità di aminoacidi, la probabilità di un evento di scissione casuale è relativamente bassa per una proteasi virale che riconosce sequenze proteiche di 6-8 aminoacidi o più a lungo. La previsione di SSHHPS nelle proteine ospiti dipenderà in gran parte dalla specificità della proteasi virale esaminata. Se la proteasi ha requisiti di specificità di sequenza rigorosi, la possibilità di trovare una sequenza di sito di scissione è 1/206 – 1 in 64 milioni o 1/208 – 1 in 25,6 miliardi; tuttavia, la maggior parte delle proteasi hanno tolleranze di siti secondari variabili (ad esempio, R o K possono essere tollerate sul sito S1). Di conseguenza, non vi è alcun requisito per l’identità della sequenza tra le sequenze trovate nell’host rispetto al virus. Per le proteasi virali che hanno requisiti di sequenza più sciolti (come quelli appartenenti a Picornaviridae) la probabilità di trovare un sito di scissione in una proteina ospite può essere maggiore. Molte delle voci della Tabella 1 provengono dalla famiglia Picornaviridae.
La notazione Schechter & Berger20 è comunemente usata per descrivere i residui in un substrato proteasi e i siti secondari a cui si legano, utilizziamo questa notazione in tutto. I residui nel substrato che sono N-terminale del legame di scissile sono indicati come P3-P2-P1, mentre quelli che sono C-terminalsono sono indicati come P1′-P2′-P3′. I corrispondenti sottositi della proteasi che legano questi residui di amminoacidi sono rispettivamente S3-S2-S1 e S1′-S2′-S3′.
Per determinare quali proteine ospiti sono presi di mira, possiamo identificare SSHHPS nei siti di scissione della poliproteina virale e cercare le proteine ospiti che le contengono. Qui, illustreremo le procedure per identificare SSHHPS utilizzando sequenze note di scissione proteasi virale. I metodi bioinformatici, i saggi proteasi e nei metodi in silico descritti sono destinati ad essere utilizzati in combinazione con saggi basati sulle cellule.
Gli allineamenti delle sequenze delle proteine ospiti bersaglio delle proteasi virali hanno rivelato differenze specifiche delle specie all’interno di queste brevi sequenze di scissione. Ad esempio, la proteasi del virus dell’encefalite equina venezuelana (VEEV) nsP2 è stata trovata per tagliare l’TRIM14 umano, una proteina tripartita (TRIM)6. Alcune proteine TRIM sono fattori di restrizione virale (ad esempio, TRIM5– 21), la maggior parte sono pensati per essere ligas ubiquitina E3. TRIM14 manca di un dominio RING (davvero interessante nuovo gene) e non è pensato per essere un E3 ligase22. TRIM14 è stato proposto come un adattatore nel signaloso antivirale mitocondriale (MAVS)22, ma può avere altre funzioni antivirali23. L’allineamento delle sequenze di TRIM14 da varie specie mostra che gli equini non hanno il sito di scissione e ospitano una versione troncata di TRIM14 che manca del dominio PRY/SPRY del terminale C. Questo dominio contiene un sito di poliubiquitination (Figura 2). Nell’equino, questi virus sono altamente letali (mortalità del 20-80%), mentre nell’uomo umano solo l’1% muore a seguito di infezioni da VEEV24. La cleavage del dominio PRY/SPRY può cortocircuito transitoriamente cortocircuito della cascata di segnalazione MAVS. Questa cascata può essere innescata da dsRNA e porta alla produzione di interferone e citochine pro-infiammatorie. Pertanto, la presenza del SSHHPS può essere utile per prevedere quali specie hanno sistemi di difesa contro specifici virus di Gruppo IV.
Nei virus di Gruppo IV, i meccanismi di antagonismo IFN sono ritenuti moltiplicare ridondanti25. La scissione delle proteine ospiti può essere transitoria durante l’infezione e le concentrazioni possono recuperare nel tempo. Abbiamo scoperto nelle cellule che i prodotti di scissione TRIM14 potrebbero essere rilevati molto presto dopo la trasfezione (6 h) con un plasmide che codifica la proteasi (promotore di citomegalovirus). Tuttavia, a periodi più lunghi, i prodotti di scissione non sono stati rilevati. Nelle cellule infettate da virus, la cinetica era diversa e i prodotti di scissione potevano essere rilevati tra 6-48 h6. Altri hanno segnalato la comparsa di prodotti di scissione proteica ospite già 3-6 h dopo l’infezione9,11.
L’attività proteolitica nelle cellule è spesso difficile da catturare; i prodotti di scissione possono variare nella loro solubilità, concentrazione, stabilità e durata. Nei saggi basati sulle cellule, non si può presumere che i prodotti di scissione si accumulino in una cellula o che le intensità della banda delle proteine tagliate e non tagliate mostrino aumenti e diminuzioni compensative in quanto la proteina tagliata può essere degradata molto rapidamente e potrebbe non essere rilevabile in una macchia occidentale a un peso molecolare previsto (MW) (ad esempio, la regione contenente l’epipopo potrebbe essere screpolata da altri protiasi ospiti o potrebbe essere ubichezzata). Se il substrato della proteasi virale è una proteina di risposta immunitaria innata, la sua concentrazione può variare durante l’infezione. Ad esempio, alcune proteine di risposta immunitaria innata sono presenti prima dell’infezione virale e sono indotte ulteriormente dall’interferone26. La concentrazione della proteina bersaglio può quindi variare durante l’infezione e il confronto tra listi cellulari non infetti e listi cellulari infetti può essere difficile da interpretare. Inoltre, tutte le cellule potrebbero non essere trascate o infettate in modo uniforme. I saggi proteasi in vitro che utilizzano proteine purificate di E. coli, d’altra parte, hanno meno variabili per cui controllare e tali saggi possono essere fatti utilizzando SDS-PAGE piuttosto che immunoblot. Le proteasi contaminanti possono essere inibite nei primi passaggi della purificazione delle proteine del substrato CFP/YFP e le proteasi virali mutate possono essere purificate e testate come controlli per determinare se la scissione è dovuta alla proteasi virale o a una proteasi batterica contaminante.
Una limitazione dei saggi proteasi in vitro è che mancano della complessità di una cellula dei mammiferi. Affinché un enzima tagli il suo substrato, i due devono essere co-localizzati. Le proteasi virali del Gruppo IV differiscono nella struttura e nella localizzazione. Ad esempio, la proteasi di Simlasmi è incorporata nella membrana del reticolo endoplasmico (ER) e si affaccia sul citosol, mentre la proteasi VEEV nsP2 è una proteina solubile nel citoplasma e nel nucleo27. Alcune delle sequenze del sito di scissione trovate nell’analisi SSHHPS di IKV erano in peptidi di segnalazione suggerendo che la scissione potrebbe avvenire co-traduzione per alcuni obiettivi. Pertanto, anche la posizione della proteasi e del substrato nella cellula deve essere considerata in queste analisi.
I saggi basati sulle cellule possono essere utili per stabilire un ruolo per le proteine ospiti identificate nell’infezione. I metodi che mirano a fermare la scissione proteasi virale delle proteine ospiti come l’aggiunta di un inibitore della proteasi6 o una mutazione nel bersaglio ospite16 possono essere utilizzati per esaminarne gli effetti sulla replicazione virale. La sovraespressione della proteina mirata può anche influenzare la replicazione virale28. I saggi di placca o altri metodi possono essere utilizzati per quantificare la replicazione virale.
La distruzione specifica della sequenza di una proteina o di un acido nucleico guidato da una sequenza estranea si vede solo in pochi casi in biologia. I meccanismi illustrati nella Figura 1 sono meccanismi difensivi che proteggono un host da un virus o un virus da un host.
Utilizzando metodi bioinformatici possiamo identificare gli obiettivi che vengono distrutti da questi sistemi. Nelle nostre analisi delle sequenze SSHHP, abbiamo scoperto che molte di esse potrebbero essere trovate nelle proteine necessarie per generare risposte immunitarie innate. Alcuni avevano ruoli ovvi come MAVS e TRIF (TIR-domain-che induce l’interferone-z), mentre altri erano legati all’immunità anche se meccanismi più complessi (ad esempio, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Le informazioni di destinazione memorizzate nella sequenza SSHHP hanno il potenziale per identificare le vie che hanno effetti antivirali contro questi virus. Le risposte antivirali in vivo sono spesso specifiche per i virus26,43. Ad esempio, sottoinsiemi di proteine TRIM hanno effetti antivirali su diversi virus43,44,45, alcuni sono fattori di restrizione virale (ad esempio, HIV e TRIM5). La specificità delle proteine TRIM (70 dollari sono stati identificati) è ancora in fase di esame44,45. Le informazioni all’interno di SSHHPS possono contribuire alla nostra comprensione di come questi virus eludano le risposte immunitarie innate. Altri modelli e correlazioni possono essere scoperti con l’esame di un maggior numero di SSHHPS.
Differenze specifiche per specie erano evidenti nelle nostre analisi (Figura 2, Figura 10). Questi virus sono noti per colpire alcune specie più di altri. Le informazioni sulla gamma host, la suscettibilità degli host e le difese dell’host possono essere presenti all’interno di SSHHPS. Per esempio, l’equina, la specie più suscettibile ai virus dell’encefalite equina, mancava della regione dell’TRIM14 umano che veniva tagliata transitoriamente dalla proteasi VEEV nsP2. Gli esseri umani raramente muoiono per infezioni da VEEV, ma possono essere infettati24. La proteina umana TRIM14 trasportava una sequenza di scissione della proteasi nsP26. La presenza del sito di scissione suggerisce che gli esseri umani hanno un meccanismo di difesa contro questi virus. Gli uccelli sono stati pensati per essere potenziali serbatoi di questi virus46. La corrispondente sequenza SSHHP nella proteina TRIM14 dei polli differiva dalle sequenze presenti negli esseri umani e in altre specie. Sottili differenze come queste possono rendere una proteina ospite bersaglio sciaforma o più facilmente sciolsa. Aguirre et al.16 ha mostrato che una proteina STRING mutata da zio-avabile ha indotto livelli superiori di IFN dopo l’infezione da virus Dengue e che i topi portano naturalmente una versione di STING che non viene tagliata dalla proteasi Dengue ns2B3. La proteina murine STING non è stata tagliata dalla proteasi47. Nella nostra analisi SSHHPS, abbiamo anche osservato differenze nelle sequenze del sito di scissione della proteasi di IKV quando abbiamo confrontato le proteine umane con quelle dei roditori6 (Figura 10D). La riproduzione delle scissioni proteolitiche specifiche delle proteine ospiti può essere importante nei modelli animali utilizzati per i virus del Gruppo IV. L’inibizione della scissione delle proteine ospiti ha anche implicazioni per quanto riguarda lo sviluppo di inibitori della proteasi di gruppo IV. Nella nostra pubblicazione precedente, abbiamo dimostrato che potevamo inibire la scissione TRIM14 con la proteasi VEEV nsP2 utilizzando CA074 ester dimetile 6. Questo risultato suggerisce che piccoli inibitori molecolari di queste proteasi possono essere in grado di modulare le risposte immunitarie innate che sono in grado di sopprimere l’infezione6,31.
La variazione genetica all’interno di una specie ha anche il potenziale per produrre differenze nella scissione proteolitica. Sottili differenze nell’uso del codone potrebbero influenzare la pausa ribosomiana48. Poiché alcune proteasi virali di Gruppo IV sono incorporate nella membrana ER, le differenze in queste pause potrebbero influenzare la scissione di un bersaglio se la scissione si verifica in modo co-traduzione. Alcuni dei siti di scissione che abbiamo identificato erano in sequenze di peptidi di segnale previste (ad esempio, SFRP1) mentre altri erano interni.
L’analisi SSHHPS può produrre informazioni che differiscono da altri metodi di analisi delle proteine ospiti. L’analisi SSHHPS è stata poco costosa e facile da impiegare. L’uso di un sistema di espressione batterica ha permesso di testare i segmenti corti (25 aminoacidi) delle sequenze di mammiferi senza l’uso della coltura cellulare dei mammiferi. Abbiamo scoperto che i substrati CFP-YFP erano in grado di tollerare tutte le sequenze proteiche umane testate; tuttavia, le rese variavano. In analisi simili, substrati contenenti sequenze proteiche umane fino a quando 63 aminoacidi sono stati espressi con successo, purificati e utilizzati per analisi cinetiche e screening degli inibitori49,50,51. Poiché solo piccole quantità di substrato sono necessarie per il saggio discontinuo, è possibile esplorare un gran numero di obiettivi. Un vantaggio del sistema è che i substrati CFP/YFP possono essere utilizzati per le analisi SDS-PAGE e per analisi cinetiche più elaborate (cioè IC50, Ki, Km, Vmax). Per la scoperta di farmaci, i composti inibitori possono produrre artefatti nei saggi fluorescenti. Così, il saggio discontinuo in combinazione con un saggio continuo permette di confermare la scissione o l’inibizione della scissione. I campioni per il saggio SDS-PAGE discontinuo possono essere prelevati direttamente dalle piastre da 96 pozze. I substrati CFP/YFP sono stati utilizzati per lo screening della libreria composta52. Tuttavia, sono necessarie ulteriori analisi per determinare se un substrato è adatto per lo screening ad alta produttività, come il calcolo di un fattore z53.
Una sfida nella progettazione di un substrato è identificare la regione intorno al legame di scissile che è legato e riconosciuto dalla proteasi. Negli esempi mostrati qui, abbiamo iniziato con 12 sequenze di residui che sono state centrate intorno al legame scissile. Dopo aver analizzato gli allineamenti di sequenza dei siti di scissione ai residui, è stato trovato Il terminale N del legame con la scientifica VEEV, mentre per l’omologia protease di .IKV a molti dei residui del terminale C è stato trovato. Un modello in silico del substrato ancorato può essere utilizzato per progettare esperimenti di mutagenesi diretti al sito che sondano i siti di legame del substrato. Poiché le sequenze di substrato ed enzima sono su plasmidi, sia può essere mutato per testare i modelli in silico o tolleranze subsite. Questo può essere vantaggioso se non è disponibile una struttura cristallina del substrato(s) rilegato.
L’analisi SSHHPS può anche fornire nuove informazioni sui meccanismi mediante i quali i fenotipi indotti da virus sono prodotti da enzimi virali. Uno degli obiettivi di , SFRP1, fa parte del percorso di segnalazione Wnt e ha ruoli nello sviluppo sia del cervello che dell’occhio e nelle risposte immunitarie36,37,54,55,56,57. Abbiamo scoperto che le altre sequenze proteiche che potrebbero essere tagliate dalla proteasi di n2B/ns3 erano anche in proteine coinvolte nello sviluppo di cervello e occhi; anomalie in entrambi sono stati osservati nella sindrome congenita di zika e si pensa che faccia parte del fenotipo indotto dal virus58.
La prevedibilità delle interazioni ospite-patogeno potrebbe essere sfruttata per una varietà di applicazioni: terapie virali oncolitiche specifiche del bersaglio; de-risking di vaccini contro il virus vivo; perfezionamento, previsione o selezione di modelli animali; previsione dell’intervallo o della suscettibilità dell’ospite; previsione di eventi zoonotici; e la previsione delle difese dell’ospite. Poiché i metodi descritti sono basati sulla sequenza, possono essere di valore da incorporare nel software in futuro.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dai numeri di progetto della Defense Threat Reduction Agency (DTRA) CB-SEED-SEED09-2-0061 e CBCall4-CBM-05-2-0019, e in parte dal programma di ricerca Intramurale/Extramural dei fondi di base NCATS, NIH (XH) e Naval Research Laboratory.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |