Мы представляем общий протокол для выявления коротких участков гомологичных хост-патогенных белковых последовательностей (SSHHPS), встроенных в вирусный полипротеин. SSHHPS распознаются вирусными протеазами и направляют целенаправленное уничтожение конкретных белков-хозяев несколькими вирусами группы IV.
Альфавирусные ферменты синтезируются в одном полипептиде. Неструктурный полипротеин (nsP) обрабатывается его протеазой цистеина nsP2 для производства активных ферментов, необходимых для репликации вируса. Вирусные протеазы очень специфичны и распознают сохраненные последовательности мотивов участка расщепления (аминокислоты No6-8). В нескольких группах IV вирусов, nsP протеазы (ы) расщепления сайте мотив последовательности можно найти в конкретных белков хозяина, участвующих в генерации врожденных иммунных реакций и, в некоторых случаях, целевые белки, как представляется, связаны с вирусом индуцированного фенотипа. Эти вирусы используют короткие участки гомологичных хост-патогенных белковых последовательностей (SSHHPS) для целенаправленного уничтожения белков-хозяев. Для выявления SSHHPS вирусный протеаза декольте сайте мотив последовательности могут быть введены в BLAST и геном хозяина (ы) можно искать. Расщепление первоначально может быть проверено с помощью очищенной nsP вирусной протеазы и флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET) субстратов, сделанных в кишечной палочке. Фрет субстраты содержат цианский и желтый флуоресцентный белок и последовательность участка расщепления (CFP-sequence-YFP). Этот протеаза асссе можно использовать непрерывно в считывателе плиты или discontinuously в гелях SDS-PAGE. Модели связанных пептидных субстратов могут быть созданы в силико для руководства по отбору субстратов и исследованиям мутагенеза. Субстраты CFP/YFP также использовались для выявления ингибиторов протеазы. Эти in vitro и в методах silico можно использовать в комбинации с клеточными анализами для того чтобы обусловить если пристрелнный протеин хозяина влияет на вирусную репликацию.
Доказательства горизонтальной передачи генов от вируса к хозяину, или принимающей вируса, можно найти в различных геномах1,2,3,4. Примерами вирусной эндогенизации являются последовательности прокладки CRISPR, найденные в геномах бактериальных хозяев4. Недавно мы нашли доказательства последовательности протеинов-хозяев, встроенных в неструктурные полипротеины вирусов ГРУППы IV. Эти последовательности в регионах кодирования вирусного генома могут распространяться по коленным поколениям. Короткие участки гомологичных хост-патогенных белковых последовательностей (SSHHPS) находятся в вирусе и хост5,6. SSHHPS являются сохранены декольте сайте мотив последовательности признаны вирусных протеаз, которые имеют гомологии для конкретных белков хозяина. Эти последовательности направляют уничтожение конкретных белков хозяина.
В нашей предыдущей публикации6, мы составили список всех белков хозяина, которые были направлены на вирусные протеазы и обнаружили, что список целей был неслучайным (Таблица 1). Были очевидны две тенденции. Во-первых, большинство вирусных протеаз, которые разрезали белки-хозяева, принадлежали к вирусам группы IV (24 из 25 случаев, связанных с вирусными протеазами группы IV), а одно протеас принадлежало ретровирусам ГРУППы VI (ВИЧ, вирус иммунодефицита человека)7. Во-вторых, цели протеина хозяина будучи отрезанными вирусными proteases вообще включились в производить врожденные иммунные реакции предлагая что расщепления были предназначены для того чтобы антагонизировать реакции хозяина иммунные. Половина белков хозяина, на которые нацелены вирусные протеазы, были известными компонентами сигнальных каскадов, генерирующих интерферон (IFN) и провоспалительные цитокины(таблица 1). Другие были вовлечены в транскрипцию клеток хоста8,9,10 или перевода11. Интересно, что Шмаков и др.4 показали, что многие последовательности протосказеров CRISPR соответствуют генам, участвующим в плазмидном спряжении или репликации4.
Группа IV включает в себя, среди прочего, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae, и Togaviridae. Несколько новых и возникающих патогенных микроорганизмов относятся к группе IV, таким как вирус Зика (ЗИКВ), Западный Нил (WNV), Chikungunya (CHIKV), тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) и вирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС). Геном (к) ssRNA, по сути, является частью мРНК. Для производства ферментов, необходимых для репликации генома, сначала необходимо перевести геном ssRNA. У альфавирусов и других вирусов группы IV ферменты, необходимые для репликации, вырабатываются в одном полипротеине (т.е. nsP1234 для VEEV). Неструктурный полипротеин (nsP) протеолитически обрабатывается (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) протеазой nsP2 для производства активных ферментов12 (рисунок 1). Расщепление полипротеина протеазой nsP2 имеет важное значение для репликации вируса; Это было продемонстрировано удалением и сайт-направленный мутагенез активного сайта цистеин протеаза nsP213,14. Примечательно, что перевод вирусных белков предшествует событиям репликации генома. Например, nsP4 содержит РНК-зависимую РНК-полимеразу, необходимую для репликации генома (к)SsRNA. Репликация генома может производить промежуточные dsRNA; эти промежуточные могут вызвать врожденные иммунные реакции хозяина. Таким образом, эти вирусы могут расщеплять врожденные белки иммунного ответа на ранних стадиях инфекции, чтобы подавить их действие15,16,17.
Замалчивание может происходить на уровне ДНК, РНК и белка. Что является общим для каждого из механизмов замалчивания показано на рисунке 1 является то, что короткие чужеродные ДНК, РНК, или белковые последовательности используются для руководства уничтожения конкретных целей антагонизировать их функции. Механизмы замалчивания аналогичны программам «поиск и удаление», которые были написаны на трех разных языках. Короткая последовательность сайта расщепления аналогична “ключевому слову”. Каждая программа имеет фермент, который распознает соответствие между короткой последовательности (“ключевое слово”) и слово в “файл”, который должен быть удален. После того, как совпадение найдено, фермент вырезает (“удаляет”) большую целевую последовательность. Три механизма, показанные на рисунке 1, используются для защиты хозяина от вирусов или для защиты вируса от иммунной системы хозяина.
Вирусные протеазы распознают короткие последовательности мотивов участка расщепления между аминокислотами No2-11; в нуклеотидах это соответствовало бы 6-33 базам. Для сравнения, последовательности процмеров CRISPR составляют 26-72 нуклеотидов, а РНК – 20-22 нуклеотидов18,19. Хотя эти последовательности являются относительно короткими, они могут быть признаны конкретно. Учитывая более высокое разнообразие аминокислот, вероятность случайного расщепления события является относительно низким для вирусной протеазы признания белковых последовательностей 6-8 аминокислот или дольше. Прогноз SSHHPS в белках хозяина будет во многом зависеть от специфики вирусной протеазы рассматривается. Если протеаза имеет строгие требования к специфичности последовательности последовательности последовательности секвеи, то шанс найти последовательность участка расщепления составляет 1/206 и 1 в 64 миллионаили или 1/208 и 1 в 25.6 миллиарда; однако, большинство протеаз имеют переменные допуски подсайта (например, R или K могут быть допущены на сайте S1). Следовательно, нет необходимости в последовательности идентификации между последовательностями, найденными в хоста против вируса. Для вирусных протеаз, которые имеют более слабые требования последовательности (например, принадлежащие К Picornaviridae) вероятность нахождения расщепления в протеине хозяина может быть выше. Многие из записей в таблице 1 из семьи Picornaviridae.
Schechter и Berger обозначение20 обычно используется для описания остатков в протеак субстрата и подсайтов, к которым они связывают, мы используем эту нотацию во всем. Остатки в субстрате, которые n-терминал ажиотажных облигаций обозначаются как P3-P2-P1, в то время как те, которые C-терминалобывают, обозначаются как P1′-P2′-P3′. Соответствующие подзаисы в протеазе, которые связывают эти аминокислотные остатки, являются S3-S2-S1 и S1′-S2′-S3′, соответственно.
Чтобы определить, какие белки-хозяева являются мишенью, мы можем определить SSHHPS в вирусных полипротеиновых расщепления сайтов и поиск принимающих белков, которые содержат их. В этом, мы наметили процедуры для выявления SSHHPS с использованием известных вирусных протеаза расщепления сайта последовательностей. Биоинформатические методы, протеазные анализы и описанные методы силико предназначены для использования в сочетании с клеточными анализами.
Последовательность выравниваний белков-хозяев, на которые нацелены вирусные протеазы, выявила специфические различия в этих коротких последовательностях участка расщепления. Например, венесуэльский вирус конского энцефалита (VEEV) nsP2 протеазы было установлено, сократить человека TRIM14, трехсторонний мотив (TRIM) белок6. Некоторые белки TRIM являются факторами вирусного ограничения (например, TRIM5’21),большинство из которых считаются убиквитином E3 лигазах. TRIM14 не хватает RING (действительно интересный новый ген) домена и не считается E3 лигаза22. TRIM14 было предложено быть адаптером в митохондриальной противовирусной сигналосомы (MAVS)22, но может иметь другие противовирусные функции23. Выравнивание последовательностей TRIM14 от различных видов показывает, что лошади не хватает расщепления сайта и гавани усеченной версии TRIM14, что отсутствует C-терминал PRY / SPRY домена. Этот домен содержит сайт поливиквитивиции(рисунок 2). В лошади, эти вирусы являются весьма смертоносными (20-80% смертности), в то время как у людей только 1% умирают от инфекций VEEV24. Расщепление домена PRY/SPRY может временно замыкаться сигнальным каскадом MAVS. Этот каскад может быть вызван dsRNA и приводит к выработке интерферона и провоспалительных цитокинов. Таким образом, присутствие SSHHPS может быть полезно для прогнозирования того, какие виды имеют защитные системы против конкретных вирусов группы IV.
В группе IV вирусов, IFN антагонизм механизмы, как полагают, умножить избыточные25. Расщепление белка хозяина может быть преходящим во время инфекции и концентрации могут восстановиться с течением времени. Мы обнаружили в клетках, что ПРОДУКТы расщепления TRIM14 могут быть обнаружены очень рано после трансфекции (6 ч) с плазмид кодированием протеазы (цитомегаловирусный промоутер). Однако в более длительные периоды продукты расщепления не были обнаружены. В вирусных клетках, кинетика были разными и декольте продукты могут быть обнаружены между 6-48 ч6. Другие сообщили о появлении продуктов расщепления белка хозяина уже в 3-6 ч после инфекции9,11.
Протеолитическая активность в клетках часто трудно поймать; продукты расщепления могут варьироваться в их растворимости, концентрации, стабильности и продолжительности жизни. В анализах на основе клеток, нельзя предположить, что продукты расщепления будут накапливаться в клетке или что интенсивность полосы разреза и неподрезавшего белка покажет компенсационное увеличение и уменьшение, так как вырезанный белок может быть деградирован очень быстро и не может быть обнаружен в западном подувке при ожидаемом молекулярном весе (МВт) (например, область, содержащая эпитоп, может быть смочена другими умелыми протеинтами). Если субстрат вирусной протеазы является врожденным белком иммунного ответа, его концентрация может варьироваться во время инфекции. Например, некоторые врожденные белки иммунного ответа присутствуют до вирусной инфекции и индуцируются далее интерфероном26. Таким образом, концентрация целевого белка может колебаться во время инфекции, и сравнение неинфицированных и инфицированных клеточных лисатов может быть трудно интерпретировать. Кроме того, все клетки не могут быть равномерно трансинфицированы или инфицированы. In vitro protease анализы с использованием очищенных белков из кишечной палочки, с другой стороны, имеют меньше переменных, для которых для контроля и такие assays может быть сделано с помощью SDS-PAGE, а не иммуноблотов. Загрязнение протеазы могут быть ингибированы в ранних этапах очистки белка субстрата CFP/YFP, и мутифицированные вирусные протеазы могут быть очищены и протестированы в качестве контроля, чтобы определить, если расщепление связано с вирусной протеазой или загрязняющих бактериальных protease.
Одним из ограничений in vitro protease является то, что им не хватает сложности клетки млекопитающих. Для фермента, чтобы сократить его субстрат, два должны быть совместно локализованы. Вирусные протеазы группы IV различаются по структуре и локализации. Например, протеаза ЗИКВ встроена в эндоплазмическую мембрану ретикулума (ER) и сталкивается с цитозолом, в то время как протеаза VEEV nsP2 является растворимым белком в цитоплазме и ядре27. Некоторые из последовательностей участка расщепления, найденные в анализе IKV SSHHPS, были в сигнальных пептидах, предполагая, что расщепление может происходить совместно для некоторых целей. Таким образом, в этих анализах также необходимо учитывать расположение протеазы и субстрата в клетке.
Клеточные анализы могут быть полезны для установления роли для идентифицированного белка хозяина (ы) в инфекции. Методы, которые направлены на прекращение вирусного расщепления протеаза белков-хозяев, таких как добавление ингибитора протеазы6 или мутации в цели хозяина16 могут быть использованы для изучения их воздействия на вирусную репликацию. Переэкспрессия целевого белка также может повлиять на репликацию вируса28. Доска анализы или другие методы могут быть использованы для количественной оценки репликации вируса.
Последовательность конкретных уничтожения белка или нуклеиновой кислоты руководствоваться иностранной последовательности только видели в нескольких случаях в биологии. Механизмы, показанные на рисунке 1, являются защитительными механизмами, которые защищают хозяина от вируса или вируса от узла.
Используя биоинформатические методы, мы можем определить цели, которые уничтожаются этими системами. В нашем анализе последовательностей SSHHP, мы обнаружили, что многие из них могут быть найдены в белках, необходимых для создания врожденных иммунных реакций. Некоторые из них были очевидные роли, такие как MAVS и TRIF (TIR-домен-содержащих адаптер вызывающих интерферон-я), в то время как другие были связаны с иммунитетом, хотя и более сложные механизмы (например, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. Целевая информация, хранящаяся в последовательности SSHHP, имеет потенциал для выявления путей, которые имеют противовирусные эффекты против этих вирусов. Противовирусные ответы in vivo часто являются вирусными26,43. Например, подмножества белков TRIM оказывают противовирусное воздействие на различные вирусы43,44,45, некоторые из них являются факторами вирусного ограничения (например, ВИЧ и ТРИМ5). Специфика белков TRIM (70 евро были определены) до сих пор изучается44,45. Информация в SSHHPS может способствовать нашему пониманию того, как эти вирусы уклоняются от врожденных иммунных реакций. Другие закономерности и корреляции могут быть обнаружены по мере изучения большего количества SSHHPS.
Видовые различия были очевидны в нашем анализе(Рисунок 2, Рисунок 10). Эти вирусы, как известно, влияют на некоторые виды больше, чем другие. Информация о диапазоне хоста, восприимчивости хоста и защите хоста может присутствовать в SSHHPS. Например, лошади, наиболее восприимчивые виды к вирусам конского энцефалита, не хватало области человека TRIM14, который был временно сокращен протеазой VEEV nsP2. Люди редко умирают от инфекций VEEV, но могут быть инфицированы24. Человеческий белок TRIM14 нес последовательность расщепления протеазы nsP26. Присутствие места расщепления свидетельствует о том, что люди имеют защитный механизм против этих вирусов. Птицы считались потенциальными резервуарами этих вирусов46. Соответствующая последовательность SSHHP в белке TRIM14 от кур отличалась от последовательностей, встречаемых у людей и других видов. Тонкие различия, как это может сделать целевой хозяин белка дяди или более легко расщепляться. Aguirre et al.16 показали, что неудающийся мутировавший белок STRING индуцировал более высокие уровни IFN после заражения вирусом Денге и что мыши, естественно, несут версию STING, которая не вырезана протеазой Dengue ns2B3. Белок murine STING не был вырезан протеизами47. В нашем анализе SSHHPS, мы также наблюдали различия в последовательности участка расщепления протеазы, когда мы сравнили человеческие белки с белками грызунов6 (Рисунок 10D). Воспроизведение видов конкретных протеолитических расщеплений белков-хозяев может иметь важное значение в животных моделях, используемых для вирусов группы IV. Ингибирование расщепления белка хозяина также имеет последствия в отношении развития ингибиторов протеазы группы IV. В нашей предыдущей публикации, мы показали, что мы могли бы ингибировать РАСщепление TRIM14 по протеазаve VEEV nsP2 с помощью CA074 метиловый эфир6. Этот результат показывает, что небольшие молекулы ингибиторы этих протеаз может быть в состоянии модулировать врожденные иммунные реакции, которые способны подавлять инфекцию6,31.
Генетические изменения в пределах вида также имеет потенциал для того чтобы произвести разницы в протеолическом расщеплении. Тонкие различия в использовании кодона может повлиять на рибосому паузы48. Так как некоторые группы IV вирусные протеазы встроены в мембрану ER, различия в этих паузах может повлиять на расщепление цели, если расщепление происходит совместно. Некоторые из участков расщепления, которые мы определили, были в прогнозируемых последовательности пептида сигнала (например, SFRP1), в то время как другие были внутренними.
Анализ SSHHPS может дать информацию, которая отличается от других методов анализа белка хозяина. Анализ SSHHPS был недорогим и простым в использовании. Использование бактериальной системы экспрессии позволило проверить короткие сегменты (25 аминокислот) последовательностей млекопитающих без использования культуры клеток млекопитающих. Мы обнаружили, что субстраты CFP-YFP были в состоянии переносить все проверенные последовательности белка человека; однако урожайность варьировалась. В аналогичных анализах субстраты, содержащие последовательности белка человека, до тех пор, пока 63 аминокислоты были успешно выражены, очищены и использованы для кинетической анализа и ингибитора скрининга49,50,51. Поскольку для прерывистого исследования требуется лишь небольшое количество субстрата, можно изучить большое количество целей. Одним из преимуществ системы является то, что субстраты CFP/YFP могут быть использованы для анализа SDS-PAGE и для более сложных кинетический анализ (т.е. IC50, Ki, Km,Vmax). Для обнаружения наркотиков, ингибирующие соединения могут производить артефакты в флуоресцентных анализов. Таким образом, прерывистое анализ в сочетании с непрерывным анализом позволяет подтвердить расщепление или ингибирование декольте. Образцы для прерывистого SDS-PAGE-асссса могут быть взяты непосредственно из 96-колодцев. CFP / YFP субстраты были использованы для комплексного скринингабиблиотеки 52. Тем не менее, необходимы дополнительные анализы, чтобы определить, подходит ли субстрат для скрининга высокой пропускной всей входной, например, для расчетакоэффициента 53.
Одной из задач при проектировании субстрата является определение региона вокруг ножниц, которые связаны и распознаны протеаза. В приведенных здесь примерах мы начали с 12 последовательностей остатков, которые были сосредоточены вокруг ножниц. После анализа последовательности выравнивания расщепления сайтов гомологии остатков N-терминал аж ножницы была найдена для протеазы VEEV, в то время как для гомологии протеазы ЗИКВ к нескольким c-терминал остатков был найден. В силико модель состыковатого субстрата может быть использована для разработки на сайте направлены мутагенез эксперименты, которые зондируют связывающих сайтов субстрата. Так как субстрат и ферментные последовательности находятся на плазмидах, либо можно мутировать, чтобы проверить в силико-моделях или допусков подсайта. Это может быть выгодно, если кристаллическая структура связанного субстрата (ы) недоступна.
Анализ SSHHPS может также дать новую информацию о механизмах, с помощью которых вирус-индуцированные фенотипы производятся вирусными ферментами. Одна из целей ЗИКВ, SFRP1, является частью Пути Сигнализации Wnt и играет роль в развитии мозга и глаз и в иммунных реакциях36,37,54,55,56,57. Мы обнаружили, что другие белковые последовательности, которые могут быть сокращены протеазой ziKV ns2B/ns3, также содержатся в белках, участвующих в развитии мозга и глаз; аномалии в обоих наблюдались при врожденном синдроме Зика и, как полагают, являются частью вирус-индуцированного фенотипа58.
Предсказуемость взаимодействий между хозяином и патогеном может быть использована для различных применений: специфических онколитических вирусных методов; де-риск живых вирусных вакцин; уточнение, прогнозирование или выбор моделей животных; прогнозирование дальности или восприимчивости к хозяину; прогнозирование зоонозных событий; и прогнозирование защиты хозяев. Поскольку описанные методы основаны на последовательности, они могут иметь ценность для включения в программное обеспечение в будущем.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Агентством по уменьшению оборонной угрозы (DTRA) номерами проектов CB-SEED-SEED09-2-0061 и CBCall4-CBM-05-2-0019, а отчасти – программой интрамальных/экстраморальных исследований фондов NCATS, NIH (XH) и военно-морской исследовательской лаборатории.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |