Presentamos un protocolo general para identificar tramos cortos de secuencias de proteínas homolopégicos de patógenos de host (SSHHPS) incrustadas en la poliproteína viral. SSHHPS son reconocidos por proteasas virales y dirigen la destrucción dirigida de proteínas huésped específicas por varios virus del Grupo IV.
Las enzimas alfavirales se sintetizan en un solo polipéptido. La poliproteína no estructural (nsP) es procesada por su nsP2 cisteína proteasa para producir enzimas activas esenciales para la replicación viral. Las proteasas virales son muy específicas y reconocen secuencias de motivos de sitios de escote conservadas (6-8 aminoácidos). En varios virus del Grupo IV, las secuencias de motivos del sitio de escisión de la proteasa nsP se pueden encontrar en proteínas de huésped específicas implicadas en la generación de las respuestas inmunitarias innatas y, en algunos casos, las proteínas dirigidas parecen estar vinculadas al fenotipo inducido por el virus. Estos virus utilizan tramos cortos de secuencias de proteínas homolopégicos de patógenos del huésped (SSHHPS) para la destrucción específica de proteínas huésped. Para identificar SSHHPS, se pueden introducir secuencias de motivos de sitios de proteasa viral en BLAST y se pueden buscar los genomas del huésped. El escote inicialmente se puede probar utilizando los sustratos purificados de proteasa viral nsP y transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) fabricados en E. coli. Los sustratos de FRET contienen proteína fluorescente cian y amarilla y la secuencia del sitio de escisión (CFP-sequence-YFP). Este ensayo de proteasa se puede utilizar continuamente en un lector de placas o de forma discontinua en geles SDS-PAGE. Los modelos de los sustratos peptídicos unidos se pueden generar en silico para guiar la selección del sustrato y los estudios de mutagénesis. Los sustratos de CFP/YFP también se han utilizado para identificar inhibidores de la proteasa. Estos métodos in vitro e in sálico se pueden utilizar en combinación con ensayos basados en células para determinar si la proteína huésped dirigida afecta la replicación viral.
La evidencia de la transferencia horizontal de genes del virus al huésped, o del huésped al virus, se puede encontrar en una variedad de genomas1,2,3,4. Ejemplos de endogenización viral son las secuencias espaciadoras CRISPR que se encuentran en los genomas del huésped bacteriano4. Recientemente, hemos encontrado evidencia de secuencias de proteínas huésped incrustadas en las poliproteínas no estructurales de virus (+)ssRNA Group IV. Estas secuencias dentro de las regiones codificacionales del genoma viral se pueden propagar generacionalmente. Los tramos cortos de secuencias de proteínas homólogas-patógenas (SSHHPS) se encuentran en el virus y el host5,6. SSHHPS son las secuencias de motivos del sitio de escisión conservadas reconocidas por las proteasas virales que tienen homología con proteínas anfitrionas específicas. Estas secuencias dirigen la destrucción de proteínas huésped específicas.
En nuestra publicación anterior6, compilamos una lista de todas las proteínas anfitrionas que fueron objetivo de las proteasas virales y encontramos que la lista de objetivos no era aleatoria(Tabla 1). Dos tendencias eran evidentes. En primer lugar, la mayoría de las proteasas virales que cortan las proteínas huésped pertenecían a virus del Grupo IV (24 de los 25 casos implicados en proteasas virales del Grupo IV), y una proteasa pertenecía a los retrovirus del Grupo VI (VIH, virus de inmunodeficiencia humana)7. En segundo lugar, las dianas de proteína huésped cortadas por las proteasas virales generalmente estaban involucradas en la generación de las respuestas inmunitarias innatas que sugerían que los escotes estaban destinados a antagonizar las respuestas inmunitarias del huésped. La mitad de las proteínas huésped atacadas por las proteasas virales eran componentes conocidos de las cascadas de señalización que generan interferón (IFN) y citoquinas proinflamatorias (Tabla 1). Otros participaron en la transcripción de la célula anfitriona8,9,10 o traducción11. 4han demostrado que muchas secuencias de protoespaciales CRISPR corresponden a genes implicados en la conjugación o replicación del plásmido4.
El Grupo IV incluye, entre otros, Flaviviridae, Picornaviridae, Coronaviridae, Calciviridae y Togaviridae. Varios patógenos nuevos y emergentes pertenecen al Grupo IV, como el virus del Zika (ZIKV), el Nilo Occidental (WNV), el Chikungunya (CHIKV), el virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS) y el virus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). El genoma (+)ssRNA es esencialmente un pedazo de ARNm. Para producir las enzimas necesarias para la replicación del genoma, primero debe traducirse el genoma (+)ssRNA. En alfavirus y otros virus del Grupo IV, las enzimas necesarias para la replicación se producen en una sola poliproteína (es decir, nsP1234 para el VEEV). La poliproteína no estructural (nsP) se procesa proteolíticamente (nsP1234 nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) por la proteasa nsP2 para producir enzimas activas12 (Figura 1). El escote de la poliproteína por la proteasa nsP2 es esencial para la replicación viral; esto se ha demostrado mediante la eliminación y mutagénesis dirigida por el sitio de la cisteína del sitio activo de la proteasa nsP213,14. En particular, la traducción de proteínas virales precede a los eventos de replicación del genoma. Por ejemplo, nsP4 contiene la ARN polimerasa dependiente del ARN necesaria para replicar el genoma del ARN (+). La replicación del genoma puede producir intermedios dsRNA; estos intermedios pueden desencadenar las respuestas inmunitarias innatas del huésped. Por lo tanto, estos virus pueden separar las proteínas de respuesta inmune innatas del huésped al principio de la infección con el fin de suprimir sus efectos15,16,17.
El silenciamiento puede ocurrir a nivel de ADN, ARN y proteína. Lo que es común a cada uno de los mecanismos de silenciamiento mostrados en la Figura 1 es que se utilizan secuencias cortas de ADN extraño, ARN o proteínas para guiar la destrucción de objetivos específicos para antagonizar su función. Los mecanismos de silenciamiento son análogos a los programas de “búsqueda y eliminación” que se han escrito en tres idiomas diferentes. La secuencia de sitio de escisión corta es análoga a una “palabra clave”. Cada programa tiene una enzima que reconoce la coincidencia entre la secuencia corta (la “palabra clave”) y una palabra en el “archivo” que se va a eliminar. Una vez que se encuentra una coincidencia, la enzima corta (“elimina”) la secuencia de destino más grande. Los tres mecanismos que se muestran en la Figura 1 se utilizan para defender al huésped de virus o para defender un virus del sistema inmunitario de un huésped.
Las proteasas virales reconocen secuencias de motivos cortos del sitio de escisión entre los aminoácidos de 2 a 11 años; en nucleótidos, esto correspondería a 6-33 bases. A modo de comparación, las secuencias de espaciadores CRISPR son de 26-72 nucleótidos y los ARNi son de 20 a 22 nucleótidos18,19. Aunque estas secuencias son relativamente cortas, se pueden reconocer específicamente. Dada la mayor diversidad de aminoácidos, la probabilidad de un evento de escisión aleatoria es relativamente baja para una proteasa viral que reconoce secuencias de proteínas de 6-8 aminoácidos o más. La predicción de SSHHPS en proteínas huésped dependerá en gran medida de la especificidad de la proteasa viral que se está examinando. Si la proteasa tiene requisitos estrictos de especificidad de secuencia, la posibilidad de encontrar una secuencia de sitio de escisión es de 1/206 a 1 en 64 millones o 1/208 a 1 en 25.600 millones; sin embargo, la mayoría de las proteasas tienen tolerancias de subsitio variables (por ejemplo, R o K pueden tolerarse en el sitio S1). Por lo tanto, no hay ningún requisito para la identidad de secuencia entre las secuencias encontradas en el host frente al virus. Para las proteasas virales que tienen requisitos de secuencia más flexibles (como los que pertenecen a Picornaviridae) la probabilidad de encontrar un sitio de escisión en una proteína huésped puede ser mayor. Muchas de las entradas de la Tabla 1 son de la familia Picornaviridae.
La notación Schechter & Berger20 se utiliza comúnmente para describir los residuos en un sustrato de proteasa y los subsitios a los que se unen, utilizamos esta notación en todo. Los residuos en el sustrato que son N-terminal de la unión scissile se indican como P3-P2-P1, mientras que los que son C-terminal se indican como P1′-P2′-P3′. Los subsitios correspondientes en la proteasa que unen estos residuos de aminoácidos son S3-S2-S1 y S1′-S2′-S3′, respectivamente.
Para determinar qué proteínas huésped están siendo atacadas, podemos identificar SSHHPS en los sitios de escisión de poliproteína viral y buscar las proteínas huésped que las contienen. En este documento, delineamos procedimientos para identificar SSHHPS utilizando secuencias de sitios de escisión de proteasa viral conocidas. Los métodos bioinformáticos, los ensayos de proteasa y los métodos de silico descritos están destinados a utilizarse junto con ensayos basados en células.
Las alineaciones secuenciales de las proteínas huésped a las que se dirigen las proteasas virales han revelado diferencias específicas de cada especie dentro de estas secuencias cortas del sitio de escisión. Por ejemplo, se encontró que la proteasa del virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) nsP2 cortó la proteína humana TRIM14, un motivo tripartito (TRIM)6. Algunas proteínas TRIM son factores de restricción viral (por ejemplo,TRIM5-21), la mayoría se cree que son ligasas de ubiquitina E3. TRIM14 carece de un dominio RING (realmente interesante nuevo gen) y no se cree que sea una ligasa E322. SE ha propuesto que TRIM14 sea un adaptador en el mechondriés antiviral mitocondrial (MAVS)22, pero puede tener otras funciones antivirales23. La alineación de las secuencias TRIM14 de varias especies muestra que el equino carece del sitio de escisión y alberga una versión truncada de TRIM14 que le falta el dominio PRY/SPRY del terminal C. Este dominio contiene un sitio de poliubiquitinación(Figura 2). En equino, estos virus son altamente letales (20-80% de mortalidad) mientras que en los seres humanos sólo el 1% muere a causa de las infecciones por VEEV24. El escote del dominio PRY/SPRY puede cortocircuitar transitoriamente la cascada de señalización MAVS. Esta cascada puede ser desencadenada por dsRNA y conduce a la producción de interferón y citoquinas proinflamatorias. Por lo tanto, la presencia del SSHHPS puede ser útil para predecir qué especies tienen sistemas de defensa contra virus específicos del Grupo IV.
En los virus del Grupo IV, se cree que los mecanismos de antagonismo IFN multiplican redundantes25. El escote de proteína huésped puede ser transitorio durante la infección y las concentraciones pueden recuperarse con el tiempo. Encontramos en las células que los productos de escisión TRIM14 podrían detectarse muy temprano después de la transfección (6 h) con un plásmido que codifica la proteasa (promotor del citomegalovirus). Sin embargo, en períodos más largos, no se detectaron los productos de escisión. En las células infectadas por virus, la cinética era diferente y los productos de escisión podían detectarse entre 6-48 h6. Otros han reportado la aparición de productos de escote de proteína huésped tan pronto como 3-6 h después de la infección9,11.
La actividad proteolítica en las células es a menudo difícil de detectar; los productos de escote pueden variar en su solubilidad, concentración, estabilidad y vida útil. En los ensayos a base de células, no se puede suponer que los productos de escote se acumularán en una célula o que las intensidades de la banda de proteínas cortadas y no cortadas mostrarán aumentos y disminuciones compensatorias, ya que la proteína cortada puede degradarse muy rápidamente y no puede ser detectable en una mancha occidental a un peso molecular esperado (MW) (por ejemplo, la región que contiene el epitope podría ser cortada por otros proteases del huésped o podría ser ubinada). Si el sustrato de la proteasa viral es una proteína de respuesta inmune innata, su concentración puede variar durante la infección. Por ejemplo, algunas proteínas de respuesta inmune innatas están presentes antes de la infección viral y son inducidas aún más por el interferón26. Por lo tanto, la concentración de la proteína diana puede fluctuar durante la infección y la comparación de los lysates celulares infectados no infectados puede ser difícil de interpretar. Además, es posible que todas las células no estén transfiguradas o infectadas de forma uniforme. Los ensayos de proteasa in vitro que utilizan proteínas purificadas de E. coli, por otro lado, tienen menos variables para controlar y tales ensayos se pueden hacer usando SDS-PAGE en lugar de inmunoblots. Las proteasas contaminantes pueden inhibirse en los primeros pasos de la purificación proteica del sustrato de CFP/YFP, y las proteasas virales mutadas se pueden purificar y probar como controles para determinar si el escote se debe a la proteasa viral o a una proteasa bacteriana contaminante.
Una limitación de los ensayos de proteasa in vitro es que carecen de la complejidad de una célula de mamífero. Para que una enzima corte su sustrato, los dos deben ser colocalizados. Las proteasas virales del grupo IV difieren en la estructura y la localización. Por ejemplo, la proteasa ZIKV está incrustada en la membrana de retículo endoplasmático (ER) y se enfrenta al citosol, mientras que la proteasa VEEV nsP2 es una proteína soluble en el citoplasma y el núcleo27. Algunas de las secuencias de sitios de escote encontradas en el análisis DE ZIKV SSHHPS estaban en péptidos de señal que sugieren que el escote podría ocurrir de forma co-traduccional para algunos objetivos. Por lo tanto, la ubicación de la proteasa y el sustrato en la célula también debe ser considerado en estos análisis.
Los ensayos a base de células pueden ser valiosos para establecer un papel para las proteínas huésped identificadas en la infección. Los métodos que tienen como objetivo detener la escisión de la proteasa viral de proteínas huésped como la adición de un inhibidor de la proteasa6 o una mutación en la dianahuésped 16 se pueden utilizar para examinar sus efectos en la replicación viral. La sobreexpresión de la proteína dirigida también puede afectar la replicación viral28. Los ensayos de placa u otros métodos se pueden utilizar para cuantificar la replicación viral.
La destrucción específica de una proteína o un ácido nucleico guiado por una secuencia extraña sólo se ve en unos pocos casos en biología. Los mecanismos que se muestran en la Figura 1 son mecanismos defensivos que protegen a un host de un virus o un virus de un host.
Utilizando métodos bioinformáticos podemos identificar los objetivos que son destruidos por estos sistemas. En nuestros análisis de secuencias SSHHP, descubrimos que muchas de ellas se podían encontrar en las proteínas necesarias para generar respuestas inmunitarias innatas. Algunos tenían funciones obvias como MAVS y TRIF (TIR-domain-containing adapter-inducing interferon– , mientras que otros estaban relacionados con la inmunidad a través de mecanismos más complejos (por ejemplo, Histone H3, SFRP1, FOXG1)8,9. La información de destino almacenada en la secuencia SSHHP tiene el potencial de identificar vías que tienen efectos antivirales contra estos virus. Las respuestas antivirales in vivo suelen ser específicas del virus26,43. Por ejemplo, subconjuntos de proteínas TRIM tienen efectos antivirales en diferentes virus43,44,45, algunos son factores de restricción viral (por ejemplo, VIH y TRIM5). La especificidad de las proteínas TRIM (se han identificado 70 euros) todavía se está examinando44,45. La información dentro de SSHHPS puede contribuir a nuestra comprensión de cómo estos virus evaden las respuestas inmunitarias innatas. Otros patrones y correlaciones pueden ser descubiertos a medida que se examinan más SSHHPS.
Las diferencias específicas de las especies fueron evidentes en nuestros análisis(Figura 2, Figura 10). Se sabe que estos virus afectan a algunas especies más que a otras. La información sobre el rango de host, la susceptibilidad del host y las defensas del host puede estar presente en SSHHPS. Por ejemplo, equino, la especie más susceptible a los virus de la encefalitis equina, carecía de la región de TRIM14 humano que fue cortada transitoriamente por la proteasa VEEV nsP2. Los seres humanos rara vez mueren a causa de infecciones por VEEV, pero pueden estar infectados24. La proteína humana TRIM14 llevaba una secuencia de escote de proteasa nsP26. La presencia del sitio de escisión sugiere que los seres humanos tienen un mecanismo de defensa contra estos virus. Se ha pensado que las aves son posibles reservorios de estos virus46. La secuencia SSHHP correspondiente en la proteína TRIM14 de los pollos difería de las secuencias encontradas en humanos y otras especies. Las diferencias sutiles como estas pueden hacer que una proteína huésped objetivo ativable o más fácilmente se cierre. 16 mostraron que una proteína STRING mutada inducible indujo niveles más altos de IFN después de la infección por el virus del dengue y que los ratones llevan naturalmente una versión de STING que no es cortada por la proteasa dengue ns2B3. La proteína murina STING no fue cortada por la proteasa ZIKV47. En nuestro análisis SSHHPS, también observamos diferencias en las secuencias de sitio de escisión de proteasa ZIKV cuando comparamos las proteínas humanas con las de los roedores6 (Figura 10D). La reproducción de las escotes proteolíticas específicas de la especie de proteínas huésped puede ser importante en los modelos animales utilizados para los virus del Grupo IV. La inhibición del escote de proteína huésped también tiene implicaciones con respecto al desarrollo de inhibidores de la proteasa del Grupo IV. En nuestra publicación anterior, mostramos que podríamos inhibir el escote TRIM14 por la proteasa VEEV nsP2 usando el éster metilo CA0746. Este resultado sugiere que los inhibidores de moléculas pequeñas de estas proteasas pueden ser capaces de modular las respuestas inmunitarias innatas que son capaces de suprimir la infección6,31.
La variación genética dentro de una especie también tiene el potencial de producir diferencias en el escote proteolítico. Diferencias sutiles en el uso de codón podrían afectar a la pausa ribosoma48. Dado que algunas proteasas virales del Grupo IV están incrustadas en la membrana er, las diferencias en estas pausas podrían afectar a la escisión de un objetivo si la escisión se produce de forma co-traduccional. Algunos de los sitios de escisión que identificamos estaban en secuencias de péptidos de señal pronosticadas (por ejemplo, SFRP1) mientras que otros eran internos.
El análisis SSHHPS puede producir información que difiere de otros métodos de análisis de proteínas huésped. El análisis SSHHPS era barato y fácil de emplear. El uso de un sistema de expresión bacteriana permitió la prueba de segmentos cortos (25 aminoácidos) de secuencias de mamíferos sin el uso del cultivo celular de mamíferos. Encontramos que los sustratos de CFP-YFP eran capaces de tolerar todas las secuencias de proteínas humanas probadas; sin embargo, los rendimientos variaron. En ensayos similares, sustratos que contienen secuencias de proteínas humanas hasta 63 aminoácidos fueron expresados, purificados y utilizados con éxito para análisis cinéticos y cribado de inhibidores49,50,51. Dado que sólo se necesitan pequeñas cantidades del sustrato para el ensayo discontinuo, se puede explorar un gran número de objetivos. Una ventaja del sistema es que los sustratos CFP/YFP se pueden utilizar para análisis SDS-PAGE y para análisis cinéticos más elaborados (es decir, IC50,Ki, Km, Vmáx.). Para el descubrimiento de fármacos, los compuestos inhibitorios pueden producir artefactos en ensayos fluorescentes. Por lo tanto, el ensayo discontinuo en combinación con un ensayo continuo permite confirmar el escote o la inhibición del escote. Las muestras para el ensayo discontinuo SDS-PAGE se pueden sacar directamente de las placas de 96 pocillos. Los sustratos CFP/YFP se han utilizado para el cribado de bibliotecas compuestas52. Sin embargo, se requieren análisis adicionales para determinar si un sustrato es adecuado para la detección de alto rendimiento, como el cálculo de un factor Z53.
Un desafío en el diseño de un sustrato es identificar la región alrededor de la unión escisil que está unida y reconocida por la proteasa. En los ejemplos que se muestran aquí, comenzamos con 12 secuencias de residuos que se centraron alrededor de la unión escisil. Después de analizar las alineaciones de secuencia de los sitios de escote se encontró la homología a los residuos N-terminal de la unión escisil para la proteasa VEEV, mientras que para la homología proteasa ZIKV a varios de los residuos C-terminal se encontró. Un modelo in silico del sustrato acoplado se puede utilizar para diseñar experimentos de mutagénesis dirigidos por el sitio que sondean los sitios de unión del sustrato. Dado que las secuencias de sustrato y enzimas están en plásmidos, cualquiera de los dos puede ser mutado para probar los modelos in silico o tolerancias subsitio. Esto puede ser ventajoso si una estructura cristalina del sustrato (s) unido (s) no está disponible.
El análisis SSHHPS también puede producir nueva información sobre los mecanismos por los cuales los fenotipos inducidos por virus son producidos por enzimas virales. Uno de los objetivos de ZIKV, SFRP1, es parte de la vía de señalización Wnt y tiene funciones tanto en el desarrollo del cerebro como de los ojos y en las respuestas inmunitarias36,37,54,55,56,57. Encontramos que las otras secuencias de proteínas que podrían ser cortadas por la proteasa ZIKV ns2B/ns3 también estaban en proteínas involucradas en el desarrollo del cerebro y los ojos; se han observado anomalías en ambos en el síndrome de Zika congénito y se cree que forman parte del fenotipo58inducido por el virus.
La previsibilidad de las interacciones huésped-patógeno podría ser aprovechada para una variedad de aplicaciones: terapias virales oncolíticas específicas de objetivos; desariesgo rinde riesgo a las vacunas contra los virus vivos; perfeccionamiento, predicción o selección de modelos animales; predicción del alcance del host o susceptibilidad; predicción de eventos zoonóticos; y la predicción de las defensas de los anfitriones. Dado que los métodos descritos se basan en secuencias, pueden ser de valor para incorporar en el software en el futuro.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por los números de proyecto de la Agencia de Reducción de Amenazas de Defensa (DTRA) CB-SEED-SEED09-2-0061 y CBCall4-CBM-05-2-0019, y en parte por el programa de investigación intramuros/extramuros de los fondos base NCATS, NIH (XH) y del Laboratorio de Investigación Naval.
250 mL Erlenmeyer Flask | VWR | 89000-362 | |
2-mercaptoethanol | Acros Organics (Fisher) | 125472500 | Danger: Acutely Toxic. Open bottle in hood to avoid inhaling the fumes. |
4L Pyrex wide-mouth graduated Erlenmeyer flask with screw-cap | Millipore Sigma | CLS49954L-1EA | |
AKTA Prime Plus | GE Healthcare | 17-0729-01 | |
AKTA XK 16/20 Column | GE Healthcare | 28988937 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC501096 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901096 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC801024 | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | Danger: Allergic reactions (skin or breathing). |
Chelating Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0575-02 | Once the resin is equilibrated with 0.2 M Nickel Sulfate it is refered to as a Nickel Column in the text. Column will have a green color after washing with water. The column will have a blue color after equilibrating with buffer. |
Chloramphenicol | RPI | C61000 | Danger: May cause cancer. |
Corning 50 mL centrifuge tubes | Corning | 430828 | Suggestion: Polypropylene tubes are less likely to crack during sonication than Polyethylene tubes |
Corning 96 Well Half-Area Microplate, Non-Binding Surface | Corning | 3993 | |
Dialysis Tubing Clips | Fisher Scientific | PI68011 | |
Disposable PD-10 Desalting Column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
DNAse | Sigma | DN25-1G | |
DTT (DL-Dithiothreitol) | RPI | D11000-50.0 | Warning: Acute Oral Toxicity; skin and eye irritation |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Glycerol | Acros Organics (Fisher) | 15892-0010 | |
HEPES | Millipore Sigma | H4034-1KG | |
Imidazole | Acros Organics | 301870010 | Danger: Toxic, Irritant |
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) | Calbiochem (Millipore Sigma) | 420291 | Do not breathe dust. Avoid contact with eyes and skin. |
Laemmli Sample Buffer | BIO-RAD | 1610737 | |
Luria Bertani Agar | Fluka (Millipore Sigma) | L3027-1KG | Suggestion: Autoclave with magnetic stirrer in the liquid, and stir while cooling. Wait to add antibiotic until you can hold your hands on the bottle without pain for 30 seconds. |
Luria Bertani Media | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-5g | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis CellGel Box | BIO-RAD | ||
Nalgene Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Nalgene (Thermo Scientific) | 3119-0050 | |
Nanodrop | Thermo Fisher | ||
New Brunswick Innova 42R Shaker Incubator | Eppendorf | M1335 | |
Nickel Sulfate Hexahydrate (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | N73-500 | Danger: Harmful if swallowed or inhaled, skin and eye irritation |
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C600003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
One Shot BL21(DE3) pLysS Chemically Competent E. coli | Invitrogen (Thermo Fisher) | C606003 | May be harmful if inhaled or swallowed. May cause skin and eye irritation with susceptible people. |
pet15b plasmid DNA | Novagen (Millipore Sigma) | 69661 | GenScript Inc. was used for commerical DNA synthesis. The pet15b plasmid was used for the CFP/YFP substrates. |
pet32b | Novagen (Millipore Sigma) | 69016-3 | The pet32b plasmid was used for the cysteine protease construct. |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher | A32955 | Warning: Skin corrosion/irriation; eye damage |
Plate Reader | Molecular Devices | Model M5 | |
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standard | BIO-RAD | 161-0373 | |
Protein Extraction Reagent | Novagen (Millipore Sigma) | 70584-4 | BugBuster or Bper (Catalog # 78248, ThermoFisher) |
Q-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0510-01 | Anion exchange resin |
RunBlue (12%) 17-well PAGE gels | Expedeon | BCG01227 | Any 12% pre-cast polyacrylamide gel can be used |
RunBlue 20x SDS Running Buffer | Expedeon | NXB50500 | Dilute 50 mL with 950 mL deionized water to obtain 1x |
RunBlue Instant Blue Gel Stain | Expedeon | ISB1L | Do not dilute, use as directed |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271-10 | |
Sonifier Cell Disrupter 450 Sonicator | Branson Ultrasonics (VWR) | Model No. 101-063-346R | Sonicator was used on level 5 |
Spectra/Por 6-8 kD MWCO | Spectrum Labs | 132645T | Dialysis Tubing |
SP-Sepharose Fast Flow | G.E. Healthcare | 17-0729-01 | Cation exchange resin |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T6634-500UN | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Caution: Eye/Skin Irritant |