इस विधि खनिज ऊतकों का अध्ययन करने के लिए R26R-Confetti (Confetti) माउस मॉडल के उपयोग का वर्णन करता है, छवि अधिग्रहण करने के लिए प्रजनन रणनीति से सभी चरणों को कवर. शामिल एक सामान्य प्रोटोकॉल है कि सभी नरम ऊतकों और एक संशोधित प्रोटोकॉल है कि खनिज ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है के लिए लागू किया जा सकता है.
शरीर में एक व्यक्तिगत कोशिका लेबलिंग की निगरानी करने के लिए जो सेल प्रकार यह करने के लिए वृद्धि दे सकते हैं और जीव के माध्यम से अपने प्रवास को ट्रैक या इसकी लंबी उम्र का निर्धारण ऊतक विकास और रखरखाव के तंत्र प्रकट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका हो सकता है. सबसे महत्वपूर्ण उपकरण वर्तमान में vivo में कोशिकाओं की निगरानी के लिए उपलब्ध में से एक Confetti माउस मॉडल है. Confetti मॉडल आनुवंशिक रूप से एक सेल प्रकार विशेष तरीके से विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ चूहों में रहने वाले चूहों में व्यक्तिगत कोशिकाओं लेबल और उनके भाग्य की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही समय के साथ उनकी संतान के भाग्य, एक प्रक्रिया में क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण या कहा जाता है क्लोनल वंश अनुरेखण. इस मॉडल को लगभग एक दशक पहले उत्पन्न किया गया था और कई जैविक प्रक्रियाओं की एक बेहतर समझ में योगदान दिया है, विशेष रूप से स्टेम सेल जीव विज्ञान से संबंधित, विकास, और वयस्क ऊतकों के नवीकरण. हालांकि, जब तक छवि संग्रह और विभिन्न फ्लोरोसेंट संकेतों का एक साथ कब्जा फ्लोरोसेंट संकेत के संरक्षण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से खनिज ऊतक के लिए. यह प्रकाशन विकास प्लेट उपास्थि है कि किसी भी mineralized या nonminralized ऊतक के लिए लागू किया जा सकता का विश्लेषण करने के लिए Confetti मॉडल का उपयोग करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.
बेहतर तरीकों सेल व्यवहार की निगरानी करने के लिए जब पशु मॉडल का उपयोग प्रयोगात्मक दक्षता बढ़ाने के लिए वांछनीय हैं। विवो में सेल व्यवहार पर नजर रखने के लिए सबसे जानकारीपूर्ण दृष्टिकोणमें से एक बहुरंगा रिपोर्टर माउस उपभेदों 1 के साथ क्लोनल वंश अनुरेखणहै,व्यापक रूप से इस्तेमाल किया R26R-Confetti (Confetti) माउस2सहित. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से लेबलिंग और समय के साथ उन कोशिकाओं का पालन करके, कई क्षेत्रों में शोधकर्ताओं ने Confetti माउस का इस्तेमाल किया है विभिन्न जैविक प्रणालियों की एक भीड़ में अंतर्दृष्टि प्रकट.
Confetti माउस एक loxP आधारित रिपोर्टर प्रणाली है जिसमें Cre निर्भर डीएनए पुनर्संयोजन एक stochastic तरीके से कई संभव फ्लोरोसेंट प्रोटीन में से एक की स्थायी अभिव्यक्ति का कारण बनता है2. R26R-Confetti allele सर्वव्यापक व्यक्त CAGG प्रमोटर, जो तुरंत एक loxP-फ्लैंक्ड नवआर-कैसेट2के ऊपर स्थित है, जिसका polyadenylation अनुक्रम प्रतिलेखनसमाप्त3 , उसके बाद शामिल Brainbow 2.1 निर्माण4| इसलिए, क्रे-मध्यस्थ पुनर्संयोजन एक साथनियो आर-कैसेट को बढ़ाता है और कुछ फ्लोरोसेंट प्रोटीनों के उत्पादन की ओर जाता है, जिसके आधार पर बीरेनबो 2.1 निर्माण के कुछ हिस्सों को निकाला जाता है। यह सुविधा Confetti माउस अत्यंत अनुकूलनीय बनाता है क्योंकि यह एक माउस में किसी भी सेलुलर आबादी को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जिसके लिए एक विशिष्ट क्रे तनाव उपलब्ध है. R26R-Confetti तनाव के साथ एक ऊतक-विशिष्ट क्रे तनाव के पार लेबलिंग की विशिष्टता प्रदान करता है. हालांकि, क्रेज़ भी प्रेरक होना चाहिए (जैसे, CreERT या CreERT2, जो tamoxifen बाध्यकारी की आवश्यकता के लिए उन्हें नाभिक में प्रवेश करने के लिए और डीएनए पुनर्संयोजन प्रेरित करने की अनुमति5)ताकि लेबलिंग निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर प्राप्त किया जा सकता है. इस प्रकार, एक सेलुलर जनसंख्या परिणामी CreERT-positive/Confetti-सकारात्मक संतानों को वांछित समय बिंदु पर tamoxifen के साथ इंजेक्शन लगाकर लेबल किया जा सकता है और एक निश्चित उम्र के लिए ट्रैक किया जा सकता है, जब ब्याज के ऊतकों को विश्लेषण के लिए एकत्र किया जा सकता है। ऊतक प्रसंस्करण के बाद, फ्लोरोसेंट लेबल कोशिकाओं को सीधे confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है ताकि प्रत्येक शुरू में लेबल सेल की संतान उनके विशिष्ट फ्लोरोसेंट के आधार पर किसी भी अन्य लेबल सेल द्वारा उत्पन्न संतान से अलग किया जा सकता है लेबल, जिससे क्लोनलिटी का मूल्यांकन किया जा करने के लिए अनुमति देता है (यानी, क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण).
कॉन्फेटी मॉडल के लचीलेपन के कारण, यह स्वास्थ्य और रोग2,6,7,8,9में कई विभिन्न ऊतकों के विकास और रखरखाव के अध्ययन के लिए लागू किया गया है, 10,11. मॉडल का उपयोग करने के लिए एक आम तरीका कोशिकाओं की एक निश्चित आबादी लेबल और निर्धारित करने के लिए जो ऊतकों वे (और / इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए ऐसा ही एक निष्कर्ष यह था कि वयस्क दांत में ग्लिल मूल 6 वाली कोशिकाएं होतीहैं. मॉडल का एक अन्य आवेदन स्टेम सेल homeostasis का अध्ययन करने के लिए है. उदाहरण के लिए, Confetti मॉडल से पता चला कि आंतों crypts में स्टेम सेल niches धीरे-धीरे monoclonal हो क्योंकि कुछ स्टेम सेल क्लोन स्टेम सेल2के बीच प्रतिस्पर्धा के दौरान प्रमुख हैं. मॉडल भी सेल प्रसार है, जो धीरे धीरे विभाजित कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, आर्टिकुलर उपास्थि12 में क्लोनल गठन का मूल्यांकन किया गया था, और पांच सप्ताह पुराने चूहों में विकास प्लेट कोन्ड्रोसाइट्स पर एक हेजहॉग विरोधी के अल्पकालिक प्रभाव का अध्ययन किया गया13.
Confetti मॉडल के रिश्तेदार सादगी के बावजूद, फ्लोरोसेंट संकेत तकनीकी रूप से छवि संग्रह तक बनाए रखने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से जब खनिज ऊतकों का विश्लेषण. यहाँ, प्रोटोकॉल प्रसव के बाद की हड्डी के साथ Confetti माउस का उपयोग करने के लिए एक अनुकूलित मॉडल का वर्णन करता है (उम्र के 6 महीने तक), फ्लोरोसेंट प्रोटीन को सक्षम करने के लिए सीधे इम्यूनोडिटेक्शन के लिए आवश्यकता के बिना confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की. यह सरलीकृत प्रोटोकॉल गैर खनिजीकृत ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, शामिल कैसे नमूने स्टोर करने के लिए कम से कम 3 साल की एक लंबी अवधि के लिए फ्लोरोसेंट संकेत की रक्षा के लिए एक विवरण है. प्रोटोकॉल की एक रूपरेखा चित्र 1में प्रस्तुत की गई है।
Confetti मॉडल बड़े पैमाने पर खनिज उपास्थि ऊतकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था12,13,14 और अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन. Confetti चूहों2 एक प्रति या R26R-Confetti allele की दो प्रतियों के साथ प्रजनन और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Brainbow 2.1 निर्माण के एक एलील के साथ चूहों में पुनर्संयोजन चार संभावित लेबल दे देंगे: लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (RFP, साइटोप्लाज्मिक), पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP, साइटोप्लाज्मिक), सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी, झिल्ली-स्थानीयकृत), और हरे रंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, नाभिक-स्थानीयकृत), जबकि समयुग्मज कंफ़ेटी चूहों में पुनर्संयोजन (यानी, Brainbow 2.1 निर्माण की दो प्रतियां युक्त) 10 संभव रंग outputs दे देंगे (RFP + आरएफपी, आरएफपी + आरएफपी + CFP, आरएफपी + GF, YFP, YFP, YFP+ YFP+ GFP, CFP+CFP, CFP+GFP, GFP+GFP). हालांकि, क्योंकि डीएनए चीरा और व्युत्क्रम घटना एक stochastic तरीके से होते हैं, GFP का उत्पादन करने के लिए पुनर्संयोजन केवल कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश में होता है, के रूप में पहले की सूचना दी2, और प्रतीत होता है सेल प्रकार या Cre लाइन द्वारा अलग है2, 12,13. इसलिए, GFP अभिव्यक्ति के लिए अग्रणी पुनर्संयोजन घटनाओं की कम घटना को देखते हुए, छह रंग outputs समयुग्मज Confetti चूहों में सबसे आम हैं.
एक महत्वपूर्ण विचार जब Confetti माउस के साथ प्रयोगों की योजना बना एक उपयुक्त क्रे तनाव मिल रहा है. सबसे पहले, के बाद से Confetti allele कई loxP साइटों है, एक पुनर्संयोजन घटना एक दूसरे4preclude नहीं करता है. इसका मतलब यह है कि अगर एक सेल लेबल और एक रंग का क्लोन का उत्पादन करने के लिए विभाजित है, अपनी बेटी कोशिकाओं में से एक में एक दूसरी पुनर्संयोजन घटना एक अलग रंग उत्पन्न होता है, जिससे सच क्लोनल विस्तार मास्किंग. इस प्रकार, noninducible Cre उपभेदों, जहां एंजाइम हमेशा सक्रिय है अगर इसी प्रमोटर सक्रिय है, उचित नहीं हैं. दूसरा, कुछ उपभेदों में Cre recombinase की अभिव्यक्ति अक्सर एक अंतर्जात प्रोटीन की कीमत पर आता है, जिससे अपनी खुद की एक phenotype बनाने (उदाहरण के लिए, Prg4-GFPCreERT2 दस्तक में माउस तनाव जिसमें चूहों बंदरगाह दो Creles15), तो Crealle की एक प्रति वांछनीय है. वर्णित प्रयोगों के सभी में, Col2CreERT16 की एक प्रतिलिपि या तो पुरुष या महिला माता पिता द्वारा किया गया था Col2CreERT उत्पन्न करने के लिए: Confetti चूहों, के रूप में वर्णित13. इसके बाद, ब्याज के सेल प्रकार के लिए क्रे लाइन की विशिष्टता एक महत्वपूर्ण विचार है. उदाहरण के लिए, Col2CreERT कोन्ड्रोसाइट-विशिष्ट है, लेकिन प्रारंभिक प्रसवोत्तर प्रसव17में कोन्ड्रोसाइट्स की कई अलग-अलग आबादी को लेबल करता है। अंत में, विभिन्न क्रे उपभेदों की गतिविधि पशु उम्र के साथ काफी बदल सकते हैं, के रूप में क्रे अभिव्यक्ति परिवर्तन के लिए उपयोग प्रमोटर के अंतर्जात गतिविधि, यहां तक कि एक ही प्रकार की कोशिकाओं में (जैसे, Prg4-GFPCreERT2, जो एक बढ़ती आवश्यकता कर सकते हैं चूहों की उम्र15के रूप में सतही क्षेत्र कोशिकाओं लेबल करने के लिए tamoxifen खुराक की संख्या ).
लेबल कोशिकाओं की संख्या दिया tamoxifen की राशि से परिलक्षित होगा, तो यह हमेशा के लिए अधिकतम खुराक देने के लिए वांछनीय नहीं है क्योंकि एक दूसरे से क्लोन भेद मुश्किल हो सकता है. क्योंकि क्रे अभिव्यक्ति विभिन्न प्रमोटरों के विनियमन के तहत और साथ ही उम्र के साथ अलग अलग होंगे, tamoxifen खुराक लेबलिंग का अनुकूलन करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को तुरंत पुनर्संयोजन ट्रिगर पर फ्लोरोसेंट नहीं कर रहे हैं क्योंकि समय होने के लिए पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक है और जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट प्रोटीन इमेजिंग के लिए पर्याप्त रूप से जमा करने के लिए. घंटे की एक विस्तृत श्रृंखला (24 डिग्री 72 एच के बीच) की जरूरत है, जो क्रे लाइन, सेल प्रकार, और पशु उम्र से प्रभावित प्रतीत होता है. के बाद से tamoxifen जैविक रूप से लंबे समय के बाद प्रशासन सक्रिय किया जा सकताहै 18 यह हमेशा अच्छी तरह से प्रत्येक मॉडल में पुनर्संयोजन दक्षता की जांच करने के लिए सलाह दी जाती है.
confocal माइक्रोस्कोपी कदम के दौरान, Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन की उत्तेजना लेजर प्रकाश द्वारा ऊतक के प्रवेश की आवश्यकता है. क्योंकि विभिन्न ऊतकों में अलग-अलग गुण होते हैं, लेजर प्रकाश सभी ऊतकों के 160 डिग्री मीटर मोटी वर्गों में प्रवेश नहीं कर सकता है। तथापि, इस प्रकार के मोटे खंडों का उपयोग वृद्धि प्लेट उपास्थि के लिए किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 2चित्र 3में प्रयुक्त किया गया है। ध्यान दें कि हर माइक्रोस्कोप अलग है, और यह संभावना नहीं है कि वर्णित सेटिंग्स (अनुपूरक फाइल 1) मामूली समायोजन के बिना पूरी तरह से काम करेंगे. प्रमुख चुनौतियों में से एक के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन भेद करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ एक चैनल से दूसरे में कोई संदूषण नहीं है. उदाहरण के लिए, YFP चैनल में संकेत GFP से आने वाले फ्लोरोसेंट के कारण YFP और RFP चैनल के बीच ओवरलैप करता है। YFP और CFP चैनलों को भी सावधानी से जाँच की जानी चाहिए. यह कई तरीकों से किया जा सकता है। सबसे पहले, फ्लोरोसेंट प्रकाश तरंगदैर्ध्य है कि प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए दर्ज कर रहे हैं की उत्सर्जन रेंज सीमित किया जा सकता है. दूसरा, डिजिटल लाभ के साथ संयोजन में लेजर शक्ति का समायोजन संकेत का अनुकूलन कर सकते हैं. इस अध्ययन में इन चरणों के लिए पर्याप्त थे, लेकिन वे एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत पर भरोसा करते हैं. इसका मतलब यह है कि सिद्धांत रूप में, अक्षम ऊतक प्रसंस्करण फ्लोरोसेंट प्रोटीन की गतिविधि को कम कर सकते हैं, या एक कमजोर लेजर प्रकाश स्रोत चैनल जुदाई ख़राब कर सकते हैं.
Confetti माउस के फायदे में से एक यह है कि यह आनुवंशिक रूप से उत्परिवर्ती उपभेदों की एक बड़ी संख्या है कि उपलब्ध हैं ताकि क्लोनल गतिशीलता पर विशिष्ट जीन के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है के साथ जोड़ा जा सकता है10,11,12 ,13,14,19,20, हालांकि कुछ सीमाओं के साथ . उदाहरण के लिए, Confetti alleles और ब्याज के जीन के पुनर्संयोजन अलग नहीं किया जा सकता है जब Cre loxP आधारित उत्परिवर्ती क्लोनल वंश अनुरेखण के साथ संयुक्त का उपयोग कर. फिर भी , इस तरह के संयोग पुनर्संयोजन की घटनाओं प्रभावी हो सकताहै 10,14,20. उदाहरण के लिए, इस संभावना के लिए चूहों के आराम क्षेत्र में वृद्धि हुई कोशिका संख्या का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रसव के बाद कोन्ड्रोसाइट-विशिष्ट विकास प्लेट21 में TSC1 के ablation और समय के साथ इन कोशिकाओं के बीच क्लोनल संबंध से पता चला 13. इसके अतिरिक्त, कंफ़ेटी चूहों का उपयोग कर ऊतक-विशिष्ट क्लोनल विश्लेषण गैर-Cre loxP-आधारित उत्परिवर्ती चूहों11के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है , और यह भी औषधीय8,9 के साथ इन तरीकों गठबंधन करने के लिए संभव है ,13 और / या शल्य मॉडल8 अन्य कार्यात्मक क्षोभ के लिए क्लोनल प्रतिक्रियाओं कल्पना करने के लिए. इसके अलावा अवसर उत्पन्न तब होते हैं जब कॉन्फेटी लेबल वाले वर्गों को इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा अंतर्जात प्रोटीन के इम्यूनोडिटेक्शन के साथ संयोजित किया जाता है। इस तरह के विश्लेषण का पता लगाया कोशिकाओं की पहचान और एक ज्ञात मार्कर के साथ उनके colocalization की अनुमति देता है. इसमें वर्णित निर्धारण विधि के साथ, इम्यूनोफ्लोरेसी का संचालन करना और अभी भी कंफ़ेटी फ्लोरोसेंट प्रोटीन12,13से फ्लोरोसेंट की कल्पना करना संभव है। तथापि, उल्लिखित पत्रों में प्रतिजन पुनः प्राप्ति की आवश्यकता नहीं थी। इस तरह के साइट्रेट बफर में उबलते के रूप में हर्ष प्रतिजन पुनर्प्राप्ति तरीकों, Confetti फ्लोरोसेंट की एक पूरी हानि की ओर जाता है। हालांकि Confetti फ्लोरोसेंट प्रोटीन तो एंटीबॉडी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है22, क्लोनल पहचान का नुकसान हो सकता है.
सारांश में, Vivo में कोशिकाओं लेबल करने के लिए Confetti मॉडल का उपयोग कर समय के साथ उन कोशिकाओं के भाग्य का विश्लेषण करने के लिए एक जानकारीपूर्ण उपकरण है. वर्णित विधि खनिज ऊतकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति सीधे कल्पना करने के लिए एक तेज और कुशल तरीका प्रदान करता है।
The authors have nothing to disclose.
हम methodological सलाह के लिए डॉ Evgeny Ivashkin धन्यवाद. यह काम आर्थिक रूप से स्वीडिश अनुसंधान परिषद (ए.एस.सी), रूसी वैज्ञानिक फाउंडेशन (एएससी के लिए #19-15-00241 अनुदान), Karolinska संस्थान (ए.एस.सी.), StratRegen KI और Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-rsfond (ए.एस.सी.), Stiftelsen द्वारा समर्थित किया गया था फ्रिमुरे बरनहुसेट और सालस्कापेट बार्नवार्ड (पी.टी.एन.), चीनी छात्रवृत्ति परिषद (बी.जेड.)। confocal माइक्रोस्कोप Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया.
2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Corn oil | Sigma | C8267 | |
Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
OCT | Sakura | 102094-104 | |
Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
PBS | Gibco | 14200075 | |
Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |