Подготовка митохондрий из тканей рака яичников и контроль тканей яичников для количественного анализа протеомики
Summary
В этой статье представлен протокол центрифугирования дифференциальной скорости в сочетании с центрифугированием градиента плотности, чтобы отделить митохондрии от тканей рака яичников человека и контролировать ткани яичников для количественного анализа протеомики, в результате высококачественный митохондриальный образец и высокой пропускной и высокой воспроизводимости количественного анализа протеомики рака яичников митохондриального протеома.
Abstract
Рак яичников является распространенным гинекологическим раком с высокой смертностью, но неясным молекулярным механизмом. Большинство раковых заболеваний яичников диагностируются в продвинутой стадии, что серьезно затрудняет терапию. Митохондриальные изменения являются отличительной чертой рака яичников человека, и митохондрии являются центрами энергетического метаболизма, сигнализации клеток и окислительного стресса. Глубокое понимание изменений митохондриального протеома при раке яичников по сравнению с контролем тканей яичников поможет углубленное понимание молекулярных механизмов рака яичников, а также открытие эффективных и надежных биомаркеров и терапевтических целей. Эффективный метод митохондриальной подготовки в сочетании с изоббарической меткой для относительной и абсолютной количественной протеомики (iTRA) представлены здесь для анализа рака яичников человека и контроля митохондриальных протео, включая дифференциальную скорость центрифугирования, центрифугирование градиента плотности, оценку качества образцов митохондриального, пищеварение белка с трипсином, маркировку iTRA, сильную фракционность обмена катиона (SCX), жидкую хроматографию (LC), тандемную масс-спектрометрию (MS/ MS), анализ баз данных и количественный анализ митохондриальных белков. Многие белки были успешно определены, чтобы максимизировать охват рака яичников человека митохондриального протеома и для достижения дифференциально выраженный профиль митохондриального белка в раке яичников человека.
Introduction
Рак яичников является распространенным гинекологическим раком с высокой смертностью, но неясным молекулярным механизмом1,2. Большинство случаев рака яичников диагностируется на продвинутой стадии, что серьезно затрудняет терапию. Митохондриальные изменения являются отличительной чертой рака яичников человека, и митохондрии являются центрами энергетического метаболизма, сигнализации клеток, и окислительного стресса3,4,5,6,7. Глубокое понимание изменений митохондриального протеома при раке яичников по сравнению с контролем тканей яичников поможет углубленное понимание молекулярных механизмов рака яичников, а также открытие эффективных и надежных биомаркеров и терапевтических целей. Митохондриальный метаболизм был предложен и признан в качестве мишени для терапии рака, и антимитохондриальная терапия может в конечном итоге быть очень полезным для предотвращения рецидива и метастазирования рака8. Индивидуальное метаболическое профилирование также уже практикуется как полезный инструмент для стратификации рака и прогностических стратегий9,10.
Долгосрочная цель этого исследования заключается в разработке и использовании количественного метода митохондриальной протеомики для изучения рака яичников для уточнения изменений митохондриального протеома между раком яичников и контроля тканей яичников, и их молекулярные изменения сети от систематического угла мультиомики11,12, что приведет к открытию митохондрий целевых молекулярных биомаркеров13 для уточнения молекулярных механизмов рака яичников, прогнозирование и персонализированное лечение больных раком яичников. Изобарические метки для относительной и абсолютной количественной оценки (iTRA) маркировки3,4 являются эффективным методом количественной оценки изменений митохондриального белка. Приготовление высококачественных образцов митохондрий из рака яичников человека и контроль тканей яичников являются необходимым условием для количественного анализа митохондриальных протеом3. Митохондриальная подготовка в сочетании с iTRA’ количественной протеомики была успешно использована в долгосрочных исследовательских программ о человеческом раке яичников митохондриальной протеоме, в том числе создание митохондриальной протеомей3, анализ дифференциально выраженных митохондриальных профилей4,14 и пост-трансляционных модификаций, в том числе фосфогенных изменения сети в рака яичников человека5, в том числе изменения в энергетическом метаболизме4, липидный метаболизм, и митофагии пути-системы3.
Предыдущие исследования показали, что дифференциальная скорость центрифугирования в сочетании с плотностью градиента центрифугирования является эффективным методом для изоляции и очистки митохондрий от рака яичников человека и контроля тканей яичников3,4,5,14. Маркировка iTRA’ в сочетании с сильным обменом катионов (SCX)-жидкой хроматографии (LC)-тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) является ключевым методом для обнаружения, идентификации и количественной оценки белков из подготовленных образцов митохондрий.
Здесь описаны подробные протоколы для митохондриальной подготовки в сочетании с количественной протеомикой iTRA. Они успешно используются в анализе человеческих раковых опухолей ткани митохондриальных протеомов. Протоколы включают в себя подготовку образцов, дифференциальную скорость центрифугирования, центрифугирование градиента плотности, оценку качества митохондриальных образцов, пищеварение белка с трипсином, маркировку iTRA, фракционацию SCX, LC, MS/MS, поиск базы данных и количественный анализ митохондриальных белков. Кроме того, этот протокол легко переводится для анализа других человеческих тканей митохондриальных протеомов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Митохондриальные изменения являются отличительной чертой рака яичников. Приготовление высококачественных образцов митохондриального из рака яичников человека и контрольных тканей для крупномасштабной количественной протеомики способствует глубокому пониманию митохондриальной ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Хунань провинциальной сто талантов плана (к X.З.), Xiangya больницы фонды для ввода талантов (к X ), Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 81572278 и 8127298 до X ” Проект (Грант No 2014AA020610-1 до ХЗ) и Фонд естественных наук провинции Хунань Китая (Грант No 14JJ7008 до X). Х.З. задумал концепцию настоящей рукописи, получил количественные данные iTRA’ количественной протеомики образцов митохондрий, написал и пересмотрел рукопись, координировал соответствующую работу и отвечал за финансовую поддержку и соответствующую Работы. H.L. подготовил образцы митохондрий. С.З. участвовал в частичной работе. Х.Х.З. участвовал в написании и редактировании английского языка. Н.Л. проанализировал данные протеомики iTRA. Все авторы одобрили окончательную рукопись.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
Riferimenti
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of “free radical diseases”. Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
