Préparation des mitochondries à partir des tissus du cancer de l'ovaire et des tissus ovariens de contrôle pour l'analyse quantitative de la protéomique
Summary
Cet article présente un protocole de centrifugation différentielle-vitesse en combination avec la centrifugation de gradient de densité pour séparer des mitochondries des tissus humains de cancer de l’ovaire et commander des tissus ovariens pour l’analyse quantitative de protéomique, résultant en un échantillon mitochondrial de haute qualité et l’analyse quantitative de protéomique à haut débit et à haute reproductibilité d’un protéome mitochondrial humain de cancer de l’ovaire.
Abstract
Le cancer de l’ovaire est un cancer gynécologique commun avec la mortalité élevée mais le mécanisme moléculaire peu clair. La plupart des cancers de l’ovaire sont diagnostiqués à un stade avancé, ce qui entrave sérieusement la thérapie. Les changements mitochondriaux sont une caractéristique des cancers de l’ovaire humain, et les mitochondries sont les centres du métabolisme énergétique, de la signalisation cellulaire et du stress oxydatif. Des informations approfondies sur les changements du protéome mitochondrial dans les cancers de l’ovaire par rapport au tissu ovarien témoin bénéficieront d’une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires du cancer de l’ovaire, et de la découverte de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques efficaces et fiables. Une méthode efficace de préparation mitochondriale couplée à une étiquette isobarique pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) des protéomiques quantitatifs sont présentées ici pour analyser le cancer de l’ovaire humain et contrôler les protéomes mitochondriaux, y compris la centrifugation à vitesse différentielle, la centrifugation du gradient de densité, l’évaluation de la qualité des échantillons mitochondriaux, la digestion des protéines avec la trypsine, l’étiquetage iTRAQ, la fractionnement fort de l’échange de cation (SCX), la chromatographie liquide (LC), la spectrométrie de masse en tandem (MS/ MS), l’analyse de base de données, et l’analyse quantitative des protéines mitochondriales. De nombreuses protéines ont été identifiées avec succès afin de maximiser la couverture du protéome mitochondrial du cancer de l’ovaire humain et d’atteindre le profil de protéines mitochondriales exprimé s’exprimant différemment dans les cancers de l’ovaire humain.
Introduction
Le cancer de l’ovaire est un cancer gynécologique commun avec une mortalité élevée mais mécanisme moléculaire peu clair1,2. La plupart des cancers de l’ovaire sont diagnostiqués à un stade avancé, ce qui entrave sérieusement la thérapie. Les changements mitochondriaux sont une caractéristique des cancers de l’ovaire humain, et les mitochondries sont les centres du métabolisme énergétique, de la signalisation cellulaire et du stress oxydatif3,4,5,6,7. Des informations approfondies sur les changements du protéome mitochondrial dans les cancers de l’ovaire par rapport au tissu ovarien témoin bénéficieront d’une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires du cancer de l’ovaire, et de la découverte de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques efficaces et fiables. Le métabolisme mitochondrial a été proposé et identifié comme cible pour la thérapie de cancer, et la thérapie antimitochondriale pourrait finalement être très salutaire pour empêcher la répétition et la métastes du cancer8. Le profilage métabolique individuel est également déjà pratiqué comme un outil utile pour la stratification du cancer et les stratégies prédictives9,10.
L’objectif à long terme de cette recherche est de développer et d’utiliser une méthode quantitative de protéomique mitochondriale pour étudier le cancer de l’ovaire pour clarifier les altérations du protéome mitochondrial entre le cancer de l’ovaire et les tissus ovariens témoins, et leurs altérations du réseau moléculaire à partir d’un angle multi-omique systématique11,12, qui se traduira par la découverte de mitochondries ciblées biomarqueurs moléculaires13 pour la clarification des mécanismes moléculaires du cancer de l’ovaire, et le traitement personnalisé des patients atteints du cancer de l’ovaire. Les étiquettes isobariques pour l’étiquetage relatif et absolu (iTRAQ)3,4 sont une méthode efficace pour quantifier les changements de protéine mitochondriale. La préparation d’échantillons mitochondriaux de haute qualité provenant du cancer de l’ovaire humain et des tissus ovariens témoins est la condition préalable à l’analyse quantitative iTRAQ des protéomes mitochondriaux3. La préparation mitochondriale couplée à la protéomique quantitative iTRAQ a été utilisée avec succès dans des programmes de recherche à long terme sur le protéome mitochondrial du cancer de l’ovaire humain, y compris l’établissement de cartes de référence du protéome mitochondrial3, l’analyse des profils mitochondriaux exprimés différemment4,14 et des modifications post-traductionnelles, y compris la phosphorylation, qui a déjà abouti à la découverte d’importantes voies de signalisation. changements de réseau dans les cancers humains de l’ovaire5, y compris les altérations du métabolisme énergétique4, le métabolisme des lipides, et mitophagie voies-systèmes3.
Des études antérieures ont révélé que la centrifugation à vitesse différentielle en combinaison avec la centrifugation de gradient de densité est une méthode efficace pour isoler et purifier les mitochondries du cancer de l’ovaire humain et contrôler les tissus ovariens3,4,5,14. L’étiquetage iTRAQ couplé à un échange de cation forte (SCX)-chromatographie liquide (LC)-tandem spectrométrie de masse (MS/MS) est la technique clé pour détecter, identifier et quantifier les protéines des échantillons mitochondriaux préparés.
Ici, des protocoles détaillés pour la préparation mitochondriale coupléavec à la protéomique quantitative d’iTRAQ sont décrits. Ceux-ci ont été utilisés avec succès dans l’analyse des protéomes mitochondriaux de tissu de cancer de l’ovaire humain. Les protocoles comprennent la préparation d’échantillons, la centrifugation à vitesse différentielle, la centrifugation du gradient de densité, l’évaluation de la qualité des échantillons mitochondriaux, la digestion des protéines avec la trypsine, l’étiquetage iTRAQ, la fractionnement SC, La SP, la SP/MS, la recherche de base de données et l’analyse quantitative des protéines mitochondriales. En outre, ce protocole se traduit facilement pour analyser d’autres protéomes mitochondriaux de tissu humain.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les altérations mitochondriales sont une caractéristique du cancer de l’ovaire. La préparation d’échantillons mitochondriaux de haute qualité provenant du cancer de l’ovaire humain et des tissus témoins pour la protéomique quantitative à grande échelle bénéficie de la compréhension approfondie de la fonction mitochondriale dans la pathogénie du cancer de l’ovaire et les changements du réseau moléculaire mitochondrial, et aide à clarifier son mécanisme moléculaire pour la découverte ultérieure de la th…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Hunan Provincial Hundred Talent Plan (à X.Z.), le Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (à XZ), la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 et 81272798 à XZ), les subventions de la Chine “863” Plan Projet (Grant No. 2014AA020610-1 à XZ), et la Fondation provinciale des sciences naturelles du Hunan de Chine (Grant No. 14JJ7008 à XZ). X.Z. a conçu le concept du présent manuscrit, a obtenu les données quantitatives de protéomique iTRAQ des échantillons de mitochondries, a écrit et révisé le manuscrit, a coordonné le travail pertinent, et a été responsable du soutien financier et correspondant Travail. H.L. a préparé des échantillons de mitochondries. S.Q. a participé à des travaux partiels. X.H.Z a participé à l’écriture et à l’édition de l’anglais. N.L. a analysé les données protéomiques d’iTRAQ. Tous les auteurs ont approuvé le manuscrit final.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
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