הכנת מיטוכונמיטומיה של רקמות סרטן השחלות בקרת רקמות השחלות עבור ניתוח פרוטאומוניקס כמותיים
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול של צנטריפוגה מהירות דיפרנציאלי בשילוב עם צפיפות מעבר הצבע צנטריפוגה המיטו, מרקמות סרטן השחלות האנושי ושליטה רקמות השחלות עבור ניתוח פרוטקומניקס כמותיים, וכתוצאה מכך מדגם מיטוכונדריאלי באיכות גבוהה, תפוקה גבוהה ו-high-, בדיקת פרוטאומוניקס כמותית של סרטן השחלות האנושי פרוטדום מיטוכונדריאלי.
Abstract
סרטן השחלות הוא סרטן גניקולוגי נפוץ עם תמותה גבוהה אך מנגנון מולקולרי לא ברור. סרטן השחלות ביותר מאובחנים בשלב מתקדם, אשר ברצינות הסלים טיפול. שינויים מיטוכונדריאלי הם סימן ההיכר של סרטן השחלות האנושי, ו המיטו, הם המרכזים של חילוף החומרים באנרגיה, איתות התא, ומתח חמצוני. תובנות מעמיקות לשינויים של הפרוטדום מיטוכונדריאלי בסרטן השחלות לעומת שליטה רקמת השחלות ייהנו הבנה מעמיקה של מנגנונים מולקולריים של סרטן השחלות, ואת התגלית של סמנים יעילים ואמינים ומטרות טיפוליות. שיטת הכנה מיטוכונדריאלי יעיל בשילוב עם תג isobaric עבור קוונפיקציה יחסיים ומוחלטים (iTRAQ) פרוטאומניקס כמותיים מוצגים כאן כדי לנתח את סרטן השחלות האנושי בקרת פרוטמס מיטוכונדריזה, כולל צנטריפוגה מהירות דיפרנציאליות, צפיפות מעבר הצבע צנטריפוגה, הערכת איכות של דגימות מיטוכונדריאלי, העיכול חלבונים עם טריפסין, תיוג iTRAQ, שבירה חזקה של החלפת קטיון (SCX), כרומטוגרפיה נוזלית (LC), בטנדם ספקטרומטר מסה (MS/ MS), ניתוח מסדי נתונים, ניתוח כמותי של חלבונים מיטוכונדריאלי. חלבונים רבים זוהו בהצלחה כדי למקסם את הסיקור של סרטן השחלות האנושי פרוטדום מיטוכונדריאל ולהשיג את פרופיל חלבון מיטוכונדריאלי הביע האדם בסרטן השחלות האנושי.
Introduction
סרטן השחלות הוא סרטן גניקולוגי נפוץ עם תמותה גבוהה אך מנגנון מולקולרי לא ברור1,2. רוב סוגי סרטן השחלות מאובחנים בשלב מתקדם, אשר ברצינות הסלים טיפול. שינויים מיטוכונדריאלי הם סימן ההיכר של סרטן השחלות האנושית, ו המיטומטר הם מרכזי חילוף החומרים של אנרגיה, תא איתות, ומתח חמצוני3,4,5,6,7. תובנות מעמיקות לשינויים של הפרוטדום מיטוכונדריאלי בסרטן השחלות לעומת שליטה רקמת השחלות ייהנו הבנה מעמיקה של מנגנונים מולקולריים של סרטן השחלות, ואת התגלית של סמנים יעילים ואמינים ומטרות טיפוליות. חילוף חומרים מיטוכונדריאלי הוצע והוכר כיעד לטיפול בסרטן, antimitochondrial therapy עשוי בסופו של דבר להיות מועיל מאוד למניעת הישנות גרורות של סרטן8. פרופיל מטבולית בודדים כבר מתרגלת גם ככלי שימושי עבור סרטן ריבוד ואסטרטגיות ניבוי9,10.
לטווח ארוך המטרה של מחקר זה היא לפתח ולהשתמש מיטוכונדריאלי כמותי פרוטאומוניקס שיטה ללמוד סרטן השחלות לבירור של שינויים מיטוכונדריאלי השחלה בין סרטן השחלות בקרת רקמות השחלות, ואת שינוי הרשת המולקולרית שלהם מזווית מרובת מעגלים שיטתית11,12, אשר תגרום לגילוי של המיטואים ממוקד בסמנים מולקולריים13 להבהרה של המנגנונים המולקולריים של סרטן השחלות, חיזוי, וטיפול אישי של חולי סרטן השחלות. תגי איקובארית לקוונפיקציה יחסיים ומוחלטים (itraq) תיוג3,4 הם שיטה יעילה לכמת את שינויי חלבון מיטוכונדריאלי. הכנת דוגמאות מיטוכונדריאלי באיכות גבוהה מסרטן השחלות האנושי ורקמות השחלות בקרת הם תנאי הקדם של iTRAQ ניתוח כמותי של פרוטמס מיטוכונדריזה3. הכנה מיטוכונדריאלי משולב עם itraq כמותי פרוטאומניקס כבר בשימוש בהצלחה תוכניות לטווח ארוך על סרטן השחלות האנושי מיטוכונדריאלי, כולל הקמת מפות התייחסות מיטוכונדריאלי פרוטדום3, ניתוח של פרופילים מיטוכונדריאלי הביע באופן משמעותי4,14 ו-translational שינויים, כולל ז הרשת שינויים בסרטן השחלות האנושית5, כולל שינויים בחילוף החומרים של אנרגיה4, מטבוליזם השומנים, ואת מסלול מיטואופגיה מערכות3.
מחקרים קודמים מצאו כי צנטריפוגה מהירות משולבת בשילוב עם צפיפות הדרגתי צנטריפוגה היא שיטה יעילה כדי לבודד ולטהר את המיטומטר מסרטן השחלות האנושי בקרת רקמות השחלות3,4,5,14. התיוג iTRAQ בשילוב עם החלפת קטיון חזקה (SCX)-כרומטוגרפיה נוזלית (LC)-טנדם המסה (MS/MS) היא טכניקת המפתח כדי לזהות, לזהות, ולכמת את החלבונים מתוך דגימות מיטוכונדריאלי מוכן.
כאן, פרוטוקולים מפורטים עבור הכנה מיטוכונדריאלי יחד עם iTRAQ כמותי פרוטאומניקס מתוארים. אלה השתמשו בהצלחה בניתוח של סרטן השחלות האנושי מיטוכונדריזה רקמות. הפרוטוקולים כוללים הכנת דגימות, מהירות דיפרנציאלית צנטריפוגה, צפיפות צנטריפוגה הדרגתי, הערכת איכות של דגימות מיטוכונדריאלי, העיכול חלבונים עם טריפסין, iTRAQ תיוג, משבר SCX, LC, MS/MS, חיפוש מסד נתונים, וניתוח כמותי של חלבונים מיטוכונדריאלי. יתר על כן, פרוטוקול זה מיתרגם בקלות לנתח מיטוכונדריזה רקמות האדם אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים מיטוכונדריאלי הם סימן ההיכר של סרטן השחלות. הכנתדוגמאות מיטוכונדריאלי באיכות גבוהה מסרטן השחלות האנושית ורקמות בקרה בקנה מידה גדול פרוטאוניקס כמותיים תועלת ההבנה העמוקה של תפקוד מיטוכונדריאלי בסרטן השחלות בפתוגנזה ומיטוכונדר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מחוז הונאן 100 כישרון תוכנית (כדי X.Z.), קרנות החולים Xiangya למבוא כשרונות (כדי XZ), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט No. 81572278 ו 81272798 ל XZ), מענקים מסין “863” תוכנית פרוייקט (גרנט No. 2014AA020610-1 ל-XZ), ואת הקרן המחוזית למדעי הטבע של סין (גראנט No. 14JJ7008 כדי XZ). X.Z. הגה את הקונספט של כתב היד הנוכחי, השיג את iTRAQ כמותי הנתונים של דגימות המיטוגרם, כתב ושונה את כתב היד, מתואם את העבודה הרלוונטית, והיה אחראי על התמיכה הפיננסית והמקביל עבודה. H.L. מוכנים דגימות המיטו,. S.Q. השתתפו בעבודה חלקית. X. H. Z השתתפה בכתיבה ועריכה של השפה האנגלית. N.L. ניתח את נתוני ה-iTRAQ. כל המחברים אישרו את כתב היד הסופי.
Materials
| BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
| Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
| Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
| Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
| MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
| Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
| PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
| Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
| Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
| Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |
Riferimenti
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).
- Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
- Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
- Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
- Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
- Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
- Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of “free radical diseases”. Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
- Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
- Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
- Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
- Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2 (2013).
- Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
- Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
- McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455 (2018).
- Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
- Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).
- Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
- Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).
- Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
- Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
- Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008 (2018).
