スクレラクチニアン細胞集団の分離のための蛍光活性化細胞選別
Summary
サンゴは、人間と海洋生物の両方にとって重要な生物多様性生態系を作り出します。しかし、多くのサンゴ細胞の可能性と機能をまだ理解していません。ここでは、石のサンゴ細胞集団の単離、標識、分離のために開発されたプロトコルを紹介する。
Abstract
サンゴ礁は、人類起源のストレッサーによって脅威にさらされています。これらのストレッサーに対するサンゴの生物学的応答は細胞レベルで起こり得るが、メカニズムはよく理解されていない。ストレッサーに対するサンゴの反応を調べるには、細胞応答を分析するためのツールが必要です。特に、細胞集団がストレスにどのように反応しているかを理解するために、機能アッセイの適用を容易にするツールが必要です。今回の研究では、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、石のサンゴの異なる細胞集団を分離します。このプロトコルには、(1)骨格からのサンゴ組織の分離、(2)単一細胞懸濁液の作成、フローサイトメトリー用の各種マーカーを用いたサンゴ細胞の標識、および(4)ゲーティングおよび細胞選別戦略が含まれる。この方法により、研究者は、さまざまな細胞集団の分析、機能アッセイ、遺伝子発現研究のために、細胞レベルでサンゴに取り組む。
Introduction
サンゴ礁は地球上で最も重要な生態系の一つです。彼らは、魚や無脊椎動物に重要な生息地を提供することによって生物多様性を促進し、観光を通じて食料と経済的生活を提供することによって人類起源のコミュニティを維持するために重要です1.サンゴ礁のキービルダーとして、サンゴの動物(Phylum:Cnidaria)はまた、波と嵐の被害を軽減する大きな炭酸カルシウムフレームワークを作成することにより、沿岸のコミュニティを支援します 2.
大人としてのサンゴは、ウイルス、アルカエア、細菌、プロティスト、真菌、そして最も顕著に、藻類ジノフラゲラートファミリーシンビオダニア科シンビオダニア科のメンバーを含む幅広いendosymbioticパートナーをホストするセシル動物である。環境の変化は、このコミュニティの不均衡を引き起こす可能性があり、多くの場合、共生シンビオジニア科がサンゴのコロニーから追放される病気の流行やサンゴの漂白につながり、サンゴの主要な栄養源を排除します。これらのシナリオの両方は、多くの場合、サンゴのホスト44、5、65の死を6引き起こします。急速な気候変動のような人為的ストレス源の影響は、大量のサンゴの死のイベントを加速し、サンゴ礁の世界的な減少につながっている7.
最近、サンゴ礁の損失を軽減するために、さまざまな方法が開発されています。これらの方法には、既存のサンゴ礁へのサンゴの植え付け、熱的に耐性な遺伝子型を用いた遺伝的交差、およびサンゴ内でホストされる微生物および共生群の細胞操作が,含まれる。これらの努力にもかかわらず、サンゴ細胞の多様性と細胞機能10、11、12、13,12,については、まだまだまだ不明です。10,13サンゴ細胞の多様性と細胞機能を十分に理解することは、サンゴの生物が規範的でストレスの多い条件下でどのように振る舞うかを理解する必要があります。復元と保存の効率を最大化する取り組みは、細胞の多様性と遺伝子機能がどのように結合されているかを理解する上で役立ちます。
細胞の多様性と機能に関する以前の研究は、主に組織学的研究と組織全体RNAサンプリング1414、15、16、1715,16に焦点を17当てていました。サンゴの特定の細胞型機能に関するより詳細な情報を得るためには、生きたサンゴ細胞の特定の集団を単離する方法が必要です。これは、蛍光活性化細胞選別(FACS)フローサイトメトリー技術18によって非古典モデル生物において正常に行われている。FACSは、さまざまな波長に合わせたレーザーの組み合わせを利用して、相対細胞サイズ、細胞粒度、自己蛍光などの単一細胞レベルで異なる内因性細胞特性を測定します。さらに、細胞は、特定の、所望の特性18、19,19を測定するために蛍光標識された化合物によってマークされてもよい。
これまで、サンゴ細胞へのフローサイトメトリーの適用は、主にそれらの強い、自然自家蛍光20、21、22,21,22を利用して共生共生共生共生および他の細菌集団の分析のためであった。FACSはまた、参照モデル生物細胞23,24に対して蛍光DNAマーカーシグナルを用いてサンゴゲノムサイズを24推定するためにも用いられている。FACSの効率的な適用は細胞生物学の研究のために有用である3つの異なったツールを提供する:1)単一細胞の形態学的および機能的記述;2) 下流の研究のための特定の細胞集団の同定、分離および分離;3)単一細胞レベルでの機能アッセイの分析。
サンゴ細胞の研究のための様々な外因性蛍光マーカーの開発と応用はほとんど未踏のままです。そのようなマーカーは、タグ付きタンパク質、酵素のタグ付き基質、または他の化合物に対する蛍光応答を含むことができる。これらのマーカーは、リソソームのような特定の細胞コンパートメント機能の様々な量を生成する細胞を強調するなど、ユニークな特性を持つ細胞タイプを識別するために使用できます。その他の例としては、蛍光標識ビーズを使用して、貪食に適した細胞を機能的に同定すること、または標的病原体25の巻き込みである。免疫応答で活性な細胞の集団は、これらの外因性に適用されたビーズの巻き込み後にFACSによって容易に同定することができる。従来の組織学的方法では、保存された組織とビーズ巻き込みのための細胞陽性の割合を近似するために何時間も必要ですが、病原体の巻き込みのためのFACSベースの機能アッセイは、単離された生きた細胞に比較的迅速に実行することができます。ストレスに対する細胞特異的な反応を研究することに加えて、この技術は、遺伝子特異的発現を解明し、カリコ芽細胞やクニドサイトのような細胞型に完全に特有の細胞型の進化的および発達的歴史を明らかにする可能性を秘めています。
最近では、30以上の細胞マーカーを集中的にスクリーニングし、サンゴ細胞に標識が可能な24個を同定し、そのうち16個はユニークな集団18を区別するのに有用であり、分化クラスター(CD)を作った。ここでは、ポシロポラダミコーンスにおけるサンゴ細胞単離法が炭酸カルシウム骨格から細胞を除去することから、FACSを用いた特定の細胞集団の同定および単離に及ぶ過程について説明する(図1)。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、ローゼンタールら18から適応され、P.ダミコーンの細胞の同定および単離のために開発された。この方法論は、相対細胞サイズ、相対細胞粒度、細胞自家蛍光、無傷の細胞膜の存在を含む細胞固有因子の検査を通じて、破片、生存不可能な細胞、および共生細胞を除去するためにサンプルをフィルタリングするプロセスに焦点を当てています。これ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTKは、この研究に資金を提供するための自然科学と工学のマイアミ大学研究賞を認めたいと思います.BRは、比較進化免疫学研究所に資金を提供してくれたアレックスとアン・ラウターバッハに感謝したいと思います。BRの研究は、イスラエル科学財団(ISF)番号によって支援されました: 1416/19 と 2841/19, HFSP研究助成金, RGY0085/2019.ザンナ・コゼクバエワとマイク・コネリーの技術支援に感謝します。また、マイアミ大学、ミラー医学部のフローサイトメトリー共有リソースに、シルベスター総合がんセンターのFACSサイトメーターへのアクセスとシャノン・サイグの技術サポートに感謝したいと思います。
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
Riferimenti
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A “nugget of hope” for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. Anatomy. Diseases of Coral. , 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutté, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
