Fluorescensaktiveret cellesortering til isoleractiniske cellepopulationer
Summary
Koraller skaber biodiverse økosystemer, der er vigtige for både mennesker og marine organismer. Men vi forstår stadig ikke det fulde potentiale og funktion af mange koraller celler. Her præsenterer vi en protokol udviklet til isolering, mærkning og adskillelse af stenede koraller cellepopulationer.
Abstract
Koralrev er truet på grund af menneskeskabte stressfaktorer. Den biologiske reaktion af koraller til disse stressfaktorer kan forekomme på et cellulært niveau, men mekanismerne er ikke godt forstået. For at undersøge koraller svar på stressfaktorer, vi har brug for værktøjer til at analysere cellulære reaktioner. Vi har især brug for værktøjer, der letter anvendelsen af funktionelle analyser for bedre at forstå, hvordan cellepopulationer reagerer på stress. I den aktuelle undersøgelse bruger vi fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) til at isolere og adskille forskellige cellepopulationer i stenede koraller. Denne protokol omfatter: (1) adskillelse af koraller væv fra skelettet, (2) oprettelse af en enkelt celle suspension, (3) mærkning af koraller celler ved hjælp af forskellige markører for flow cytomettri, og (4) gating og celle sortering strategier. Denne metode vil gøre det muligt for forskere at arbejde på koraller på celleniveau til analyse, funktionelle analyser og genekspressionsundersøgelser af forskellige cellepopulationer.
Introduction
Koralrev er et af de vigtigste økosystemer på Jorden. De fremmer biodiversiteten ved at tilvejebringe kritiske levesteder for fisk og hvirvelløse dyr og er afgørende for at opretholde menneskeskabte samfund ved at give fødevarer og økonomiske levebrød gennem turisme1. Som den vigtigste bygherre af koralrev, koral dyr (Phylum: Cnidaria) også støtte kystsamfund ved at skabe store calciumcarbonat rammer, der afbøder bølge og storm skader2.
Koraller som voksne er sessile dyr, der er vært for en bred vifte af endosymbiotiske partnere, herunder virus, archaea, bakterier, protister, svampe, og især medlemmer af alge dinoflagellate familie Symbiodiniaceae3. Ændringer i miljøet kan forårsage ubalancer i dette samfund, ofte fører til sygdomsudbrud og koral blegning, hvor symbiotiske Symbiodiniaceae er bortvist fra koraller koloni, og dermed fjerne den vigtigste kilde til ernæring for koraller. Begge disse scenarier ofte forårsage død af koraller vært4,5,6. Virkningerne af menneskeskabte-induceret stressfaktorer, såsom hurtige klimaændringer, accelererer masse koraller død begivenheder, hvilket fører til en global nedgang i koralrev7.
For nylig er mange forskellige metoder blevet udvikletfor at hjælpe med at afbøde koralrev tab. Disse metoder omfatterudplantning af koraller på eksisterende rev, genetisk passage ved hjælp af termisk tolerante genotyper, og cellulære manipulation af mikrobielle og symbiotiske samfund vært inden for koraller8,9. På trods af disse bestræbelser er meget stadig ukendt om koraller celle mangfoldighed og cellefunktion10,11,12,13. En grundig forståelse af koraller celle type mangfoldighed og cellefunktion er nødvendig for at forstå, hvordan koraller organismen opfører sig under normative og stressende forhold. Bestræbelserne på at maksimere restaurering og konservering effektivitet vil drage fordel af en øget forståelse af, hvordan celle mangfoldighed og genfunktion er koblet.
Tidligere arbejde med cellediversitet og -funktion har primært fokuseret på histologiske undersøgelser og RNA-prøvetagning af hele væv14,15,16,17. For at få flere detaljer om specifikke celletype funktion i koraller, der skal være metoder til isolering af specifikke populationer af levende koraller celler. Dette er blevet gjort med succes i ikke-klassificerede modelorganismer ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) cytometriteknologi18. FACS udnytter en kombination af lasere tunet til varierende bølgelængder til at måle forskellige endogene cellulære egenskaber på enkeltcelleniveau såsom relativ cellestørrelse, cellegranularitet og autofluorescens. Derudover kan cellerne være markeret med fluorescerende mærkede forbindelser til at måle specifikke, ønskede egenskaber18,19.
Hidtil har anvendelsen af flow cytometri til koraller celler hovedsagelig været til analyse af symbiotiske Symbiodiniaceae og andre bakterielle populationer ved at udnytte deres stærke, naturlige autofluorescens20,21,22. FACS er også blevet brugt til at anslå koralgenomsstørrelsen ved hjælp af fluorescerende DNA-markørsignal sammenlignet med referencemodelorganismecellerne23,24. Effektiv anvendelse af FACS giver tre forskellige værktøjer, der er nyttige for cellebiologi undersøgelser: 1) morfologiske og funktionelle beskrivelse af enkelte celler; 2) identifikation, adskillelse og isolering af specifikke cellepopulationer i nedstrømsundersøgelser og 3) analyse af funktionelle analyser på enkeltcelleniveau.
Udviklingen og anvendelsen af forskellige udefrakommende fluorescerende markører for studiet af koraller celler er næsten uudforsket. Sådanne markører kan omfatte mærkede proteiner, mærkede substrater for enzymer eller fluorescerende reaktioner på andre forbindelser. Disse markører kan bruges til at identificere celletyper, der har unikke egenskaber, f.eks. Et yderligere eksempel er brugen af fluorescerende mærkede perler til funktionelt at identificere celler, der er kompetente for fagocytose, eller opslugelse af et målrettet patogen25. Populationer af celler, der er aktive i immunitetsresponser, kan let identificeres af FACS efter opslugelse af disse eksogent anvendte perler. Mens traditionelle histologiske metoder kræver konserveret væv og mange timer til at tilnærme procentdelen af celler positiv for perle opslugelse, en FACS-baseret funktionel analyse for patogen opslugelse kan udføres relativt hurtigt på isolerede levende celler. Ud over at studere cellespecifikke reaktioner på stress, har denne teknologi potentiale til at afklare gen-specifikke udtryk og belyse den evolutionære og udviklingsmæssige historie celletyper helt unik for cnidarians, såsom calicoblasts og cnidocytes.
For nylig udførte vi en intensiv screening af over 30 cellulære markører, der resulterede i at identificere 24, der er i stand til at mærke koraller celler, hvoraf 16 er nyttige for at skelne unikke populationer18, hvilket gør dem klynger af differentiering (CD). Her beskriver vi processen med koralcelleisolation i Pocillopora damicornis fra at fjerne celler fra calciumcarbonatskelettet til identifikation og isolering af specifikke cellepopulationer med FACS (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol blev tilpasset fra Rosental et al.18 og udviklet til identifikation og isolering af P. damicornis celler. Metoden fokuserer på processen med filtrering af prøver for at fjerne snavs, ikke-levedygtige celler og Symbiodiniaceae-hostede celler gennem undersøgelse af celle iboende faktorer, herunder relativ cellestørrelse, relativ celle granularitet, celle autofluorescens, og tilstedeværelsen af intakte cellulære membraner. Disse teknikker kan anvendes på andre koraller …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NTK vil gerne anerkende University of Miami Research Awards i Naturvidenskab og Teknik for at finansiere denne forskning. BR vil gerne takke Alex og Ann Lauterbach for at have finansieret det komparative og evolutionære immunologilaboratorium. Br’s arbejde blev støttet af Israel Science Foundation (ISF) numre: 1416/19 og 2841/19, og HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Vi vil gerne takke Zhanna Kozhekbaeva og Mike Connelly for teknisk bistand. Vi vil også gerne takke University of Miami, Miller School of Medicine’s Flow Cytometry Shared Resource på Sylvester Comprehensive Cancer Center for adgang til FACS cytometer og Shannon Saigh for teknisk support.
Materials
| Airbrush Kit & Compressor | TCP Global | ABD KIT-H-SET | Paasche H Series Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit with Master TC-20 Compressor & Air Hose |
| BD FACSAria II | BD | 644832 | |
| Bone Cutters | Bulk Reef Supply | 205357 | Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter |
| Cell Strainer | Corning | 352340 | 40 um; BD Falcon; individually wrapped; sterile; nylon |
| CellRox Green | Life Technologies | C10444 | 2.5 mM in DMSO; Excitation/Emission: 485/520 nm |
| Collection bag | Grainger | 38UV35 | Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Reclosable Poly Bag with Zip Seal Closure, Clear; 2 mil Thickness |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 10mg in H2O; Excitation/Emission: 358/461 nm |
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F2442-100ML | Heat-inactivated at 57 °C for 30 minutes |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Bright-Line Hemacytometer |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| LysoTracker Deep Red | Life Technologies | L12492 | 1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm |
| Microcentrifuge tubes | VWR | 87003-294 | 1.7 mL |
| Phophate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | pH 7.4; 10X |
| Round-bottom tubes | VWR | 352063 | 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube |
| Syringe | BD | 309628 | 1 mL BD Luer-Lok Syringe sterile, singe use polycarbonate |
Riferimenti
- Bellwood, D. R., Hughes, T. P. Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs. Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).
- Ferrario, F., et al. The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation. Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).
- Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides. Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).
- Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching. Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).
- Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).
- Miller, J., et al. Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands. Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).
- Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification. Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).
- Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A “nugget of hope” for coral reefs in an era of climate change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).
- Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).
- Peters, E. C., Woodley, C. M., et al. Anatomy. Diseases of Coral. , 85-107 (2015).
- Allemand, D., Tambutté, &. #. 2. 0. 1. ;., Zoccola, D., Tambutté, S., Dubinsky, Z., Stambler, N. Coral calcification, cells to reefs. Coral Reefs: An Ecosystem in Transition. , 119-150 (2011).
- Rinkevich, B., Loya, Y. The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae. Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).
- Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms. PLoS ONE. 6 (8), e23992 (2011).
- Hayes, R. L., Bush, P. G. Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef. Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).
- Chapman, D. M., Muscatine, L., Lenhoff, H. M. Cnidarian Histology. Coelenterate Biology. , 1-43 (1974).
- Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).
- Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. Translational environmental biology: Cell biology informing conservation. Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).
- Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS). BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).
- Rosental, B., et al. Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate. Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).
- Silva-Lima, A. W., et al. Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp. Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).
- Yvan, B., et al. Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer. Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).
- Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry. Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).
- Baumgarten, S., et al. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).
- Voolstra, C. R., et al. Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Pavlov, V., et al. Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion. Science. 357 (6348), 310-314 (2017).
