CyanoGate Modüler Klonlama Araç Kiti Kullanılarak Konjugasyon ile Siyanobakterilerin Genetik Modifikasyonu
Summary
Burada, i) CyanoGate modüler klonlama araç kiti kullanarak kendi kendini çoğaltan bir vektör monte etmek açıklayan bir protokol sokulması, ii) konjugasyon ile bir siyanobakteriyel konak içine vektör tanıtmak ve iii) transgenik siyanobakteri suşları karakterize bir plaka okuyucu veya akış sitometri.
Abstract
Siyanobakteriler, yararlı endüstriyel malların yenilenebilir üretimi için genetik olarak modifiye edilebilen çeşitli prokaryotik fotosentetik organizmalar grubudur. Sentetik biyolojideki son gelişmeler, sonraki dönüşüm veya konjuga transferiçin plazmid vektörleri oluşturmak için standart laştırılmış modüler klonlama sistemi olan CyanoGate gibi çeşitli klonlama araç kitlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Burada kendi kendini çoğaltan bir vektör (örneğin, floresan marker ekspresyon kaseti taşıyan) ve cyanobakteriyel suşları Synechocystis sp içine vektör konjugal transferi montajı için ayrıntılı bir yöntem anahat. uzun UTEX 2973. Buna ek olarak, bir plaka okuyucu veya akış sitometri kullanarak genetik bir parçanın (örneğin, bir organizatör) performansını karakterize etmek için nasıl anahat.
Introduction
Siyanobakteriler doğal ve heterolog yüksek değerli metabolikürünleringeniş bir yelpazede biyosenteziçin kullanılabilir ototrofik bakteriler1,2,3,4,5, 6 . Birkaç engeller hala ticari canlılık genişletmek için aşılması gerekir, en önemlisi, heterotrofik biyo-platformlar (örneğin, Escherichia coli ve maya ile karşılaştırıldığında nispeten kötü verimleri)7. Mevcut genetik mühendislik araçlarının son genişleme ve siyanobakteriyel araştırmalarda sentetik biyoloji paradigmaalımı nın alımı bu tür zorlukların üstesinden gelmek ve daha verimli biyofabrikalar8olarak siyanobakteriler geliştirmek için yardımcı oluyor8 , 9,10.
DNA’nın siyanobakterilere dahil edilmesinde temel yaklaşımlar dönüşüm, konjugasyon ve elektroporasyonlardır. Dönüşüm veya elektroporasyon ile siyanobakterilere aktarılan vektörler “intihar” vektörleridir (yani homolog rekombinasyonları kolaylaştıran bütünleştirici vektörlerdir), kendi kendini çoğaltan vektörler ise siyanobakterilere dönüşüm, konjugasyon veya elektroporasyon. Eski için, bir protokol mühendislik modeli türler doğal dönüşüm11münasip için kullanılabilir. Daha yakın zamanda, siyanobakteriler için cyanogate adı verilen modüler bir klonlama (MoClo) araç seti, doğal dönüşüm, elektroporasyon veya konjugasyon kullanılarak mühendislik için standart bir Golden Gate vektör montaj yöntemi kullanan geliştirilmiştir12.
Golden Gate tipi montaj teknikleri son yıllarda giderek daha popüler hale gelmiştir ve montaj standartları ve parça kütüphaneleri artık çeşitli organizmalar için kullanılabilir13,14,15,16 ,17. Golden Gate tip IIS restriksiyon enzimleri (örneğin, BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI ve AarI) ve bir “tek pot” montaj reaksiyonunda birden fazla dizinin yönsel hiyerarşik montajını kolaylaştırmak için kabul eden ve benzersiz çıkıntılar kullanır. Tip IIS restriksiyon enzimleri benzersiz bir asimetrik dizi tanımak ve daha sonra sipariş DNA sürücü için istismar edilebilir bir şaşırtıcı, “yapışkan uç” kesim (genellikle 4 nükleotit [NT] çıkıntı) oluşturmak için tanıma sitelerinden tanımlanmış bir mesafe kesti montaj reaksiyonları15,18. Bu, PhytoBricks standardı19gibi ortak bir sözdizimi tarafından tanımlanan modüler Düzey 0 parçaların (örn. organizatörler, açık okuma çerçeveleri ve sonlandırıcılar) büyük kitaplıklarının geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Düzey 0 parçaları daha sonra kolayca Düzey 1 ifade kasetleri içine monte edilebilir, hangi daha karmaşık yüksek sipariş derlemeleri (örneğin, multigene ifade yapıları) seçim12,15bir kabul vektörü inşa edilebilir aşağıdaki . Golden Gate tipi montaj tekniklerinin önemli bir avantajı, dnadökümhaneleri 20,21gibi yüksek iş hacmi tesislerinde otomasyona olanak sağlamaktır, bu da karmaşık deneysel tasarımların test edilmesine olanak sağlar. kolayca el emeği ile elde edilemez.
CyanoGate kurulan Bitki MoClo sistemi12,15üzerine inşa eder. CyanoGate içine yeni bir parçası dahil etmek için, parça dizisi ilk evcilleştirilmiş olmalıdır, yani, BsaI ve BpiI için “yasadışı” tanıma siteleri kaldırılmalıdır. Açık okuma çerçevesi (yani bir kodlama dizisi, CDS) için kodlama yapan bir parça durumunda, tanıma siteleri dizideki eşanlamlı mutasyonlar oluşturarak bozulabilir (örneğin, bir kodonu aynı amino asit kalıntısını kodlayan bir alternatife değiştirerek). Bu yaklaşımlar çeşitli elde edilebilir, DNA sentezinden polimeraz zincir reaksiyonu arasında değişen (PCR) Gibson montaj22gibi amplifikasyon tabanlı stratejiler . Kullanılan ifade ana bilgisayarbağlı olarak, dikkat çeviri verimliliğini inhibe edebilecek nadir kodon giriş önlemek için alınmalıdır23. Tanıtım ve sonlandırıcı dizilerinde tanıma sitelerinin kaldırılması genellikle daha riskli bir çabadır, çünkü değişiklikler işlevi etkileyebilir ve parça beklendiği gibi performans göstermeyebilir. Örneğin, putatif transkripsiyon faktörü bağlama sitelerinde veya bir organizatör içindeki ribozom bağlama sitesinde yapılan değişiklikler, gücü ve yanıt verme yeteneğini indüksiyon/baskıya değiştirebilir. Aynı şekilde, anahtar terminatör yapısal özellikleri değişiklikler (örneğin, GC zengin kök, döngü ve poli-U kuyruk) sonlandırma verimliliği ve etkisi gen ekspresyonu 24 ,25değiştirebilirsiniz. Organizatör ve sonlandırıcı dizilerin etkinliğini tahmin etmek ve önerilen mutasyonunperformansıetkileyip etkilemeyeceğini bildirmek için çeşitli çevrimiçi kaynaklar mevcut olsada,bu araçlar genellikle kötü tahminbazlardır. siyanobakterilerde performans28,29,30. . Bu nedenle, değiştirilmiş parçaların in vivo karakterizasyonu yine de etkinliği onaylamak için önerilir. Rekalsitrant dizilerinin klonlanmasına yardımcı olmak için, CyanoGate BiyoTuğla vektör pSB4K512,16,31dayalı düşük kopya klonlama kabul vektörü içerir. Ayrıca, bir “Tasarım ve Yapı” portalı Edinburgh Genom Döküm aracılığıyla vektör tasarımı (dab.genomefoundry.org) ile yardımcı olmak için kullanılabilir. Son olarak, ve en önemlisi, CyanoGate intihar vektörleri kullanarak siyanobakteriler içine DNA tanıtmak için iki Seviye T alıcı vektör tasarımları (Düzey 2 alıcı vektörler eşdeğer)15 içerir, ya da kendini çoğaltma yeteneğine sahip geniş konak aralığı vektörler birkaç siyanobakteriyel türlerde 32,33,34.
Burada Seviye T kendi kendini çoğaltan vektörler ve Synechocystis PCC 6803 ve Synechococcus uzada UTEX 2973(Synechocystis PCC 6803 ve S. uzamı genetik modifikasyonu oluşturmak için bir protokol açıklayan üzerinde durulacak UTEX 2973 bundan sonra) konjugasyon (ayrıca üç ebeveynli miating olarak da bilinir). Bakteri hücreleri arasında DNA’nın konjugal transferi iyi tanımlanmış bir süreçtir ve daha önce mühendislik siyanobakteriyel türler için kullanılmıştır, özellikle doğal olarak yetkili olmayanlar, S. uzamış UTEX 297335gibi, 36,37,38,39,40,41. Kısacası, siyanobakteri kültürleri konjugasyon (“harekete geçirici” sağlamak için transfer edilecek vektörü (“kargo” vektörü) ve vektörleri (aynı E. coli suşlarında veya ek suşlarda) taşıyan bir E. coli suşu ile kuluçkaya yatırılır. ve “yardımcı” vektörler). Konjugal transferin gerçekleşmesi için dört temel koşul gereklidir: 1) DNA transferiile ilgili hücreler arasında doğrudan temas, 2) kargo vektörü konjugasyon sistemiyle uyumlu olmalıdır (yani, uygun bir aktarım menşei içermelidir(oriT), ayrıca bir bom (hareketlilik temeli) sitesi olarak da bilinir), 3) dna nicking protein (örneğin, mafya geni tarafından kodlanmış) bu cyanobacterium içine DNA tek iplikli transferi başlatmak için oriT dna nicks mevcut olmalı ve ifade ya kargo veya yardımcı vektörler, ve 4) transfer DNA alıcı siyanobacterium tahrip edilmemelidir (yani, örneğin, kısıtlama endokleaz aktivite)35,42. Kargo vektörünün devam edebilmesi için, çoğaltmanın kaynağının, kendi kendini çoğaltmave kız hücrelerine çoğalmasına izin vermek için alıcı siyanobakteri ile uyumlu olması gerekir. Koşullar 3 ve 4 ile yardımcı olmak için, çeşitli yardımcı vektörler Addgene ve mafya için kodlar diğer ticari kaynaklar aracılığıyla yanı sıra ev sahibi cyanobacterium43yerli enonukleazlar korumak için çeşitli metilazlar mevcuttur. Bu protokolde konjugasyon, sırasıyla pRK24 (www.addgeneorg/51950) ve pRL528 (www.addgene.org/58495) ile harekete geçirici ve yardımcı vektörleri taşıyan bir MC1061 E. coli süzme ile kolaylaştırılmıştır. Evlilik transferi için kullanılacak vektörleri seçerken dikkatli olunmalıdır. Örneğin, CyanoGate kitinde kendi kendini çoğaltıran kargo vektörü pPMQAK1-T bir Mobproteini 12için kodlar. Ancak, pSEVA421-T44değildir ve bu nedenle, mob uygun bir yardımcı vektör ifade edilmelidir. Kullanılan vektörler de hedef organizmaya uygun olmalıdır. Örneğin, Anabaena sp. PCC 7120’de verimli konjugal aktarım, harekete geçirici vektörünü sindirime karşı koruyan bir yardımcı vektör gerektirir (örneğin, pRL623, üç metilas AvaiM, Eco47iiM ve Ecot22iM)45, 46. yıl.
Bu protokolde, bir plaka okuyucu veya akış sitometresi kullanarak bir floresan marker ile parçaların (yani, organizatörler) performansını karakterize etmek için nasıl daha fazla anahat. Akış sitometreleri büyük bir popülasyon için floresanları tek bir hücre bazında ölçebilir. Ayrıca, akış sitometreleri kullanıcıların elde edilen verileri “kapı” ve arka plan gürültüsünü (örneğin, kültürdeki partikül maddeden veya kontaminasyondan) kaldırmalarına olanak sağlar. Buna karşılık, plaka okuyucular genellikle birkaç çoğaltma kuyularında, belirli bir kültür hacminin toplam floresan ölçümü elde. Plaka okuyucuların sitometrelere göre en önemli avantajları arasında daha düşük maliyet, daha yüksek kullanılabilirlik ve genellikle akış aşağı veri analizleri için uzman yazılımlara gerek yoktur. Plaka okuyucuların ana sakıncaları sitometrelere göre nispeten daha düşük hassasiyet ve ölçülen kültürlerin optik yoğunluğu ile potansiyel sorunlardır. Karşılaştırmalı analizler için, plaka okuyucu örnekleri her kuyu için normalleştirilmelidir (örn. kültür yoğunluğuölçümü için, genellikle 750 nm [OD750]’de optik yoğunlukta absorbans olarak alınan, bu da çok fazla örnek için yanlışlıklara yol açabilir. yoğun ve/veya iyi karışmaz (örn. toplama veya flokülasyona eğilimli olduğunda).
Genel bir bakış olarak, burada Seviye 0 parçaları oluşturma ilkelerini ayrıntılı olarak gösteriyoruz, ardından CyanoGate kitini kullanarak hiyerarşik montaj ve eş transferi için uygun bir vektöre klonlama. Daha sonra konjuge aktarım sürecini, floresan belirteç ifade eden axenic transkonjugant suşlarının seçimini ve bir akış sitometresi veya plaka okuyucu kullanarak floresan verilerin indensonra elde edinimi gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Golden Gate montaj ölçeklenebilirlik açısından özellikle diğer vektör montaj yöntemleri ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları vardır20,21. Bununla birlikte, Golden Gate sistemini bir laboratuvarda kurmak, çeşitli parçalar ve kabul vektör kitaplıkları ve genel montaj süreçleri ile ilgili bir aşinalık geliştirmek için zaman gerektirir. Daha karmaşık derlemeler için veya çok sayıda karmaşık derlemeyi paralel olarak ger?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar PHYCONET Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) Network Endüstriyel Biyoteknoloji ve Biyoenerji (NIBB) ve Endüstriyel Biyoteknoloji Yenilik Merkezi (IBioIC) mali destek için müteşekkiriz. GARG, AASO ve AP BBSRC EASTBIO CASE Doktora programı (hibe numarası BB/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) Doktora programı ve IBioIC-BBSRC İşbirlikçi Eğitim Ortaklığı (CTP) Doktora programı, Sıra -sıyla. Conrad Mullineaux (Londra Queen Mary Üniversitesi) ve Poul Eric Jensen ve Julie Annemarie Zita Zedler’e (Kopenhag Üniversitesi) plazmid vektörü ve protokol katkıları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz.
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
Riferimenti
- Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
- Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
- Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
- Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
- Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
- Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
- Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
- Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
- Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
- Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
- Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
- Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
- Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
- Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
- Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
- Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
- Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
- Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
- Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
- Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
- Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
- Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
- Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
- Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
- Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
- Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
- Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
- Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
- Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
- Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
- Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
- Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
- Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
- Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
- Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
- Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
- Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
- Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
- Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
- Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , 319-327 (2014).
- Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
