التحوير الجيني لبكتيريا السيانيد بالاقتران باستخدام مجموعه أدوات الاستنساخ النموذجية السيسونات
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا يصف كيفيه القيام بتجميع ناقل النسخ المتماثل ذاتيا باستخدام مجموعه أدوات الاستنساخ النموذجية سيانوكوبالامين ، ii) إدخال المتجه إلى مضيف ترتبط عن طريق الاقتران ، و iii) توصيف سلالات البكتيريا الوراثية المحورة جينيا باستخدام قارئ لوحه أو تدفق الخلوية.
Abstract
البكتيريا الزرقاء هي مجموعه متنوعة من الكائنات الضوئية الاصطناعية النواة التي يمكن تعديلها وراثيا للإنتاج المتجدد للسلع الصناعية المفيدة. وقد أدت التطورات الاخيره في البيولوجيا التركيبية إلى تطوير عده مجموعات من أدوات الاستنساخ مثل السيسونات ، وهو نظام معياري للاستنساخ النمطي لبناء ناقلات البلازميد للتحول اللاحق أو الانتقال الزوجي إلى البكتيريا الزرقاء. هنا نحن الخطوط العريضة طريقه مفصله لتجميع ناقلات ذاتية التكرار (علي سبيل المثال ، تحمل كاسيت التعبير علامة الفلورسنت) ونقل الزوجية من المتجه إلى سلالات ترتبط Synechocystis sp. 6803 أو Synechكوكوس الونجاتوس utex 2973. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نقدم وصفا لكيفيه توصيف أداء الجزء الوراثي (علي سبيل المثال ، المروج) باستخدام قارئ اللوحة أو قياس التدفق الخلوي.
Introduction
البكتيريا الزرقاء التغذية هي بكتريا يمكن استخدامها في التخليق الحيوي لمجموعه واسعه من المنتجات الايضيه ذات القيمة العالية الطبيعية وغير المتجانسة1،2،3،4،5، 6– ولا تزال هناك عده عقبات تحتاج إلى التغلب عليها لتوسيع صلاحيتها التجارية ، ولا سيما الغلات الضعيفة نسبيا مقارنه بالمنصات الحيوية غير المتجانسة (مثل القولونية والخميرة)7. ويساعد التوسع الأخير في الاداات الهندسية الوراثية المتاحة واستيعاب نموذج البيولوجيا التركيبية في البحوث الترتبطه علي التغلب علي هذه التحديات وزيادة تطوير البكتيريا الزرقاء كمصانعحيوية فعاله 8، 9و10.
النهج الرئيسية لإدخال الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء هي التحول والاقتران والكهربية. والمتجات المنقولة إلى البكتيريا الزرقاء بالتحويل أو بالكهرباء هي ناقلات “انتحاريه” (اي المتجات التكاملية التي تسهل أعاده الدمج الذاتي) ، في حين يمكن نقل ناقلات النسخ المتماثل بنفسها إلى البكتيريا الزرقاء التحويل ، الاقتران أو الكهربية. النسبة للنوع الأول ، هناك بروتوكول متاح للأنواع النموذجية الهندسية القابلة للتحول الطبيعي11. في الاونه الاخيره ، تم تطوير مجموعه أدوات الاستنساخ (MoClo) وحدات لبكتيريا السيانيد يسمي سيانوكوبالامين التي توظف طريقه موحده لتجميع ناقلات البوابة الذهبية للهندسة باستخدام التحويل الطبيعي ، الكهربي أو الاقتران12.
وقد أصبحت تقنيات الجمعية الذهبية من نوع شعبيه متزايدة في السنوات الاخيره ، ومعايير الجمعية والمكتبات جزء متاحه الآن لمجموعه متنوعة من الكائنات الحية13،14،15،16 ،17. البوابة الذهبية يستخدم نوع الانزيمات تقييد IIS (علي سبيل المثال ، BsaI ، BpiI ، BsmBI ، BtgZI و AarI) وبدله من متقبلين وتعليق فريد لتسهيل التجمع الهرمي الاتجاهي لمتواليات متعددة في “وعاء واحد” رد فعل الجمعية. تعرف الانزيمات المقيدة لنوع IIS علي تسلسل غير متماثل فريد وتقطع مسافة محدده من مواقع التعرف عليها لإنشاء قطع متداخلة ، “نهاية لزجه” (عاده ما تكون 4 نوكليوتيد [NT] المتراكمة) ، والتي يمكن استغلالها لاحقا لدفع الحمض النووي المطلوب ردود فعلالجمعية 15,18. وقد سهل هذا تطوير المكتبات الكبيرة من أجزاء المستوي 0 وحدات (علي سبيل المثال ، والمروجين ، وإطارات القراءة المفتوحة والمنهيون) المعرفة من قبل بناء جمله مشتركه ، مثل معيار PhytoBricks19. ويمكن بعد ذلك تجميع أجزاء المستوي 0 بسهوله في أشرطه التعبير المستوي 1 ، وبعد ذلك أكثر تعقيدا التجميعات ترتيب اعلي (علي سبيل المثال ، التعبير المتعدد الجينات يبني) يمكن ان يبني في ناقلات متقبل من الاختيار12،15. ومن المزايا الرئيسية لتقنيات الجمعية الذهبية من نوع البوابة هي قدرتها علي الاتمته في مرافق عاليه الانتاجيه ، مثل الحمض النووي المصهر20،21، والتي يمكن ان تسمح للاختبار التصاميم التجريبية المعقدة التي لا يمكن تحقيقه بسهوله عن طريق العمل اليدوي.
سيانوكوبالامين يبني علي نظام المصنع الثابتة moclo12،15. ولادراج جزء جديد في السيسونات ، يجب أولا ان تكون التسلسلات الجزئية مستانسه ، اي انه يجب أزاله مواقع الاعتراف “غير القانوني” لشركتي BsaI و BpiI. في حاله الترميز جزء لاطار القراءة المفتوحة (اي تسلسل الترميز ، الاقراص المدمجة) ، يمكن ان تتعطل مواقع التعرف عن طريق توليد طفرات مرادفه في التسلسل (اي تغيير كودون إلى بديل ان الرموز لنفس بقايا الأحماض الامينيه). ويمكن تحقيق ذلك من خلال مجموعه متنوعة من النهج ، بدءا من توليف الحمض النووي إلى الاستراتيجيات القائمة علي تضخيم تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) مثل جمعيه جيبسون22. اعتمادا علي المضيف التعبير المستخدمة ، ينبغي توخي الحذر لتجنب إدخال المخطوطات النادرة التي يمكن ان تمنع كفاءه الترجمة23. أزاله مواقع التعرف في تسلسل المروج والمنهي عاده مسعى أكثر خطورة ، كما قد تؤثر التعديلات علي الدالة وقد لا يؤدي الجزء كما هو متوقع. علي سبيل المثال ، يمكن ان تغير التغييرات في مواقع ربط عامل النسخ المفترض أو موقع ربط الريبوسوم داخل المروج القوه والاستجابة للتوجيه/القمع. المثل ، فان التعديلات علي الملامح الهيكلية الرئيسية المنهي (علي سبيل المثال ، الجذعية الغنية GC ، حلقه وبولي U الذيل) قد تغير كفاءه إنهاء وتاثير التعبيرالجيني 24 ،25. علي الرغم من ان العديد من الموارد علي الإنترنت متاحه للتنبؤ بنشاط متواليات المروج والمنهي ، وإبلاغ ما إذا كانت الطفرة المقترحة ستؤثر علي الأداء26،27، وهذه الاداات غالبا ما تكون ضعيفه من التنبؤات الأداء في البكتيريا الزرقاء28،29،30.. علي هذا النحو ، في توصيف الجسم المجري للأجزاء المعدلة لا يزال يوصي بتاكيد النشاط. وللمساعدة في استنساخ المتواليات المتمردة ، يتضمن السيسونات نسخه منخفضه من النسخ التي يقبلها الاستنساخ علي أساس ناقل بيوريك pSB4K512،16،31. وعلاوة علي ذلك ، فان بوابه “التصميم والبناء” متاحه من خلال مسبك الجينوم في ادنبره للمساعدة في تصميم ناقلات الامراض (dab.genomefoundry.org). وأخيرا ، والاهم من ذلك ، وتشمل سيانوكوبالامين اثنين من التصميمات ناقلات المستوي T متقبل (ما يعادل المستوي 2 المتجات متقبل)15 لإدخال الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء باستخدام ناقلات الانتحار ، أو ناقلات واسعه النطاق المضيف قادره علي النسخ المتماثل الذاتي في عده ترتبط الأنواع32،33،34.
هنا سوف نركز علي وصف بروتوكول لتوليد مستوي T ناقلات النسخ المتماثل الذاتي والتعديل الجيني لل synechالونجاتوس sti الشركة ال6803ه للامراض و Synechكوكوس الونجاتوس Utex 2973 (Synechёts الشركة الخاصة 6803 و s. Utex 2973 الاخره) عن طريق الاقتران (المعروف أيضا باسم التزاوج ثلاثي الوالدين). النقل الزوجي للحمض النووي بين الخلايا البكتيرية هو عمليه موصوفه جيدا وقد استخدمت سابقا للهندسة ترتبط الأنواع ، وخاصه تلك التي ليست مختصة بشكل طبيعي ، مثل s. الونجاتوس utex 297335، 36،37،38،39،40،41. وباختصار ، يتم احتضان الثقافات الترتبطه بسلاله كولاي التي تحمل المتجه الذي سيتم نقله (ناقل “الحمولة”) والمتجات (اما في نفس سلاله e. كولاي أو في سلالات اضافيه) لتمكين الاقتران (“المعبئ” ومتجات “المساعد”). مطلوب أربعه شروط رئيسيه لنقل الزوجية ان يحدث: 1) الاتصال المباشر بين الخلايا المتورطة في نقل الحمض النووي ، 2) يجب ان يكون ناقل البضائع متوافقا مع نظام التصريف (اي انه يجب ان يحتوي علي مصدر مناسب للتحويل (Orit) ، المعروف أيضا باسم شجره المواد (أساس التنقل) الموقع) ، 3) الحمض النووي الذي يخدع البروتين (علي سبيل المثال ، المشفرة من قبل الجينات الغوغاء ) التي نيكس الحمض النووي في orit لبدء نقل واحد تقطعت بهم السبل للحمض النووي في السيانيد يجب ان تكون موجودة وأعرب اما من ناقلات البضائع أو المساعدين ، و 4) يجب الا يدمر الحمض النووي المنقول في السيانيد المستلم (اي ، يجب ان يكون مقاوما للتدهور بواسطة ، علي سبيل المثال ، تقييد النشاط الأحادي النواة)35،42. ولكي يستمر ناقل البضائع ، يجب ان يكون منشا النسخ المتماثل متوافقا مع زرقه المتلقي للسماح بالنسخ المتماثل الذاتي والانتشار في القسم الخاص بالخلايا التابعة للابنة. للمساعدة في الظروف 3 و 4 ، تتوفر العديد من ناقلات المساعد من خلال Addgene والمصادر التجارية الأخرى التي ترمز للغوغاء وكذلك العديد من ميثيل أسيس للحماية من الكريات المحلية الاصليه في المضيف سيانوكوبالامين43. في هذا البروتوكول ، تم تسهيل الاقتران بسلاله MC1061 e. القولونية التي تحمل المعبئ وناقلات المساعد pRK24 (www. addgeneorg/51950) و pRL528 (www.addgene.org/58495) ، علي التوالي. يجب توخي الحذر عند اختيار المتجات التي سيتم استخدامها للتحويل الزوجي. علي سبيل المثال ، في عده سيانوكوبالامين الذاتي–النسخ المتماثل ناقلات البضائع pPMQAK1 الترميز للبروتين الغوغاء12. ومع ذلك ، pSEVA421 لا44، وعلي هذا النحو ، يجب ان يتم التعبير عن الغوغاء من ناقل المساعد مناسبه. وينبغي ان تكون المتجات المستخدمة مناسبه أيضا للكائن المستهدف. فعلي سبيل المثال ، يتطلب النقل الزوجي الفعال في شركه انابينا sp. 7120 ناقل المساعد الذي يحمي ناقلات المعبئ ضد الهضم (علي سبيل المثال ، pRL623 ، الذي يشفر لثلاثه ميثيل أسيس Avaim ، Eco47iiM و Ecot22iM)45، 46.
وفي هذا البروتوكول ، نقوم بتوضيح كيفيه توصيف أداء الأجزاء (اي المروجين) بعلامة فلورية باستخدام قارئ اللوحة أو مقياس التدفق الخلوي. تدفق الخلايا الخلوية قادره علي قياس الفلوري علي أساس خليه واحده لعدد كبير من السكان. وعلاوة علي ذلك ، تسمح مقاييس التدفق الخلوي للمستخدمين “ببوابه” البيانات المكتسبة وأزاله الضوضاء الخلفية (علي سبيل المثال ، من الجسيمات في الثقافة أو التلوث). وعلي النقيض من ذلك ، فان قراء اللوحات يكتسبون قياسا مضانا لحجم معين من الثقافة ، وعاده ما يكون ذلك في العديد من الآبار المتماثلة. وتشمل المزايا الرئيسية للقراء لوحه علي أجهزه قياس الكريات الخلوية انخفاض التكلفة ، وتوافر اعلي وعاده لا حاجه لبرامج متخصصة لتحليل البيانات المصب. العيوب الرئيسية للقراء لوحه هي حساسية اقل نسبيا بالمقارنة مع المضخمات الخلوية والقضايا المحتملة مع كثافة بصريه من الثقافات المقاسه. النسبة للتحليلات المقارنة ، يجب ان تكون عينات قارئ اللوحات بشكل تطبيع لكل بئر (علي سبيل المثال ، لقياس كثافة الثقافة ، التي تؤخذ عاده علي انها الامتصاص في الكثافة البصرية عند 750 نانومتر [OD750]) ، والتي يمكن ان تؤدي إلى عدم دقه العينات التي هي أيضا كثيفه و/أو غير مختلطة جيدا (علي سبيل المثال ، عندما تكون عرضه للتجميع أو التلبد).
كلمحه عامه ، وهنا نظهر بالتفصيل مبادئ توليد مستوي 0 أجزاء ، تليها الجمعية الهرمية باستخدام مجموعه سيانوكوبالامين والاستنساخ إلى ناقلات مناسبه لنقل الزوجية. ثم نقوم بإثبات عمليه النقل الزوجية ، واختيار سلالات التحويلات التي تعبر عن علامة فلورية ، والحصول لاحقا علي البيانات الفلورية باستخدام مقياس التدفق الخلوي أو قارئ اللوحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
البوابة الذهبية الجمعية لديها العديد من المزايا مقارنه مع غيرها من وسائل التجميع ناقلات, لا سيما من حيث قابليه20,21. ومع ذلك ، يتطلب إنشاء نظام البوابة الذهبية في المختبر وقتا لتطوير إلمام بالأجزاء المختلفة والمكتبات المتجهة المتقبلة وعمليات التجميع الشامل?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم لشبكه التكنولوجيا الحيوية والبيولوجية الصناعية ومركز الابتكار في مجال التكنولوجيا الحيوية الصناعية (IBioIC) للدعم المالي. GARG, AASO و AP الاعتراف بالدعم التمويلي من برنامج الدكتوراه الحالة المالية BBSRC EASTBIO (منحه رقم BB/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) برنامج الدكتوراه, و IBioIC-BBSRC شراكه التدريب التعاوني (CTP) برنامج الدكتوراه, التوالي. نشكر كونراد موليليفو (جامعه الملكة ماري في لندن) ، وبول اريك جينسن ، وجولي Annemarie يتا زيسلر (جامعه كوبنهاجن) للحصول علي ناقلات البلازميد والمساهمات والمشورة في البروتوكول.
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
Riferimenti
- Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
- Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
- Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
- Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
- Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
- Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
- Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
- Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
- Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
- Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
- Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
- Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
- Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
- Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
- Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
- Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
- Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
- Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
- Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
- Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
- Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
- Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
- Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
- Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
- Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
- Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
- Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
- Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
- Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
- Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
- Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
- Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
- Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
- Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
- Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
- Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
- Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
- Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
- Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
- Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , 319-327 (2014).
- Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
