Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.
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Articolo metodologico
Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I cianobatteri sono un gruppo eterogeneo di organismi fotosintetici procyotici che possono essere geneticamente modificati per la produzione rinnovabile di beni industriali utili. I recenti progressi nella biologia sintetica hanno portato allo sviluppo di diversi toolkit di clonazione come CyanoGate, un sistema di clonazione modulare standardizzato per la costruzione di vettori plasmidi per la successiva trasformazione o trasferimento coniugale nei cianobatteri. Qui delineamo un metodo dettagliato per assemblare un vettore auto-replicante (ad esempio, portando una cassetta di espressione marcatore fluorescente) e il trasferimento coniugale del vettore nei ceppi cianobatterici Synechocystis sp. PCC 6803 o Synechococcus elongatus UTEX 2973. Inoltre, illustreremo come caratterizzare le prestazioni di una parte genetica (ad esempio, un promotore) utilizzando un lettore di lastre o una citometria di flusso.
Introduzione
I cianobatteri sono batteri autotrofici che possono essere utilizzati per la biosintesi di un'ampia varietà di prodotti metabolici naturali ed eterologhi di alto valore1,2,3,4,5, 6. Diversi ostacoli devono ancora essere superati per espandere la loro redditività commerciale, in particolare, le rese relativamente scarse rispetto alle bio-piattaforme eterotrofiche (ad esempio, Escherichia coli e lievito)7. La recente espansione degli strumen....
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Protocollo
1. Assemblaggio vettoriale con i toolkit Plant MoClo e CyanoGate
NOTA: Prima di procedere con l'assemblaggio vettoriale, si consiglia vivamente agli utenti di familiarizzare con le strutture a livello vettoriale dei sistemi Plant e CyanoGate MoClo12,15.
- Costruzione di parti di livello 0
NOTA: le parti di livello 0 possono essere sintetizzate come vettori completi o sequenze lineari per l'assieme con accettatori di livello 0 (ad esempio, gBlocks, IDT). In alternativa, le sequenze possono essere amplificate da un modello di origine (ad esempio, un vettore o un DNA genomic....
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Risultati
Per illustrare il flusso di lavoro dell'assieme Golden Gate, una cassetta di espressione è stata assemblata nel vettore dell'accettatore di livello 1 (Avanti) (pICH47732) contenente le seguenti parti di livello 0: promotore dell'operone C-phycocyaninPpc560 (pC0.005), la sequenza di codifica per eYFP (pC0.008) e il doppio terminatore TrrnB (pC0.082)12. In seguito alla trasformazione della reazione di assemblaggio, le assemblee.......
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Discussione
L'assemblaggio Golden Gate presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di assemblaggio vettoriale, in particolare in termini di scalabilità20,21. Tuttavia, la configurazione del sistema Golden Gate in laboratorio richiede tempo per sviluppare una familiarità con le varie parti e le librerie vettoriali dell'accettatore e i processi di assemblaggio complessivi. È spesso necessaria un'attenta pianificazione per assiemi più complessi o quando si esegue un nume.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati alla rete PHYCONET PhyCONET Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) in Industrial Biotechnology and Bioenergy (NIBB) e all'Industrial Biotechnology Innovation Centre (IBioIC) per il sostegno finanziario. GARG, AASO e AP riconoscono il sostegno al finanziamento del programma BBSRC EASTBIO CASE PhD (numero di sovvenzione BB/M010996/1), del programma di dottorato Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog-a (CONACYT) e del programma di dottorato IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP), rispettivamente. Ringraziamo Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London) e Poul Eric Jensen e Julie Annemarie (Università di ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | utilizzato in 2.1.3. |
| Adenosina 5′-trifosfato (ATP) sale disodico | Sigma-Aldrich | A2383 | utilizzato nella Tabella 2. |
| Agar (testato microbiologicamente) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Utilizzato in 8.3. |
| Agarosio | Bioline | BIO-41026 | Utilizzato in 6. |
| Citometro a flusso Attune NxT | Thermo Fisher | Scientific-Utilizzato | in 4.3.1. |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | utilizzata nella Tabella 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | utilizzato nella Tabella 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | utilizzato nella Tabella 2. |
| Carbenicillina disodica | VWR International | A1491.0005 | Utilizzato in 2.1.3. |
| Corning Costar Piastre a fondo piatto a 24 pozzetti trattate con TC | Sigma-Aldrich | CLS3527 | utilizzate in 4.1.3. |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | utilizzato in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | Kit di estrazione del DNA. Utilizzato in 5. |
| Lettore di micropiastre FLUOstar Omega | BMG Labtech-Utilizzato | in 4.2.2. | |
| GeneJET Kit di minipreparazione del plasmide | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Kit di purificazione del plasmide. Utilizzato nel passaggio 2.3.2. |
| Perle di vetro (diametro 0,5 mm) | Prodotti BioSpec | 11079105 | utilizzati in 5.2. |
| Glicerolo | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | utilizzato in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | utilizzato in 2.1.3. |
| Kanamicina solfato (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Usato in 2.1.3. |
| Filtri a membrana (0,45 μ m) | MF-Millipore | HAWP02500 | Utilizzato in 3.3.7 |
| Micropiastre, 96 pozzetti, fondo piatto (pozzetto camino) e micro; CLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | utilizzato nella versione 4.2.1. |
| Kit di estrazione del gel di DNA Monarch New | England Biolabs | T1020S | utilizzato in 1.1.2.2. |
| Kit di pulizia del DNA Monarch PCR | Kit di purificazione del DNA New England Biolabs | T1030 | . Utilizzato in 1.1.2.3. |
| Incubatrice Multitron Pro con LED | Infors HT-Shaking | incubatrice con luci LED bianche. Utilizzato in 4.1.4. | |
| MyTaq DNA polimerasi | Bioline | BIO-21108 | utilizzato in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Utilizzato in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chimicamente competente E. coli | Thermo Fisher Scientific C404010 | utilizzato in 2.1.1. | |
| Soluzione salina tampone fosfato (PBS) (concentrato 10X) | VWR International | K813 | Utilizzato in 4.3.2. |
| Q5DNA polimerasi ad alta fedeltà | New England Biolabs | M0491S | utilizzato in 1.1.2.1. |
| Scala DNA da 1 kb a caricamento rapido | New England Biolabs | N0468S | utilizzata nella Figura 4. |
| Provette con tappo a vite (1,5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Utilizzato in 3.6.3 |
| Spectinomicina dicloridrato pentaidrato | VWR International | J61820.06 | Utilizzato in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter a fondo tondo 96 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Utilizzato in 4.3.1. |
| T4 DNA ligasi | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | utilizzato nella Tabella 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Mulino per perline. Utilizzato in 5.2. |
Riferimenti
- Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
- Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering m....
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Ristampe e permessi
